人α-凝血酶

特别提示：包括人α-凝血酶在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：人α-凝血酶
英文名称：Human α-Thrombin (Factor IIa)
ＣＡＳ＃：9002-04-4

产品货号：人α-凝血酶
产品规格：100U

本品是由匀质化的人凝血酶原经由Xa因子，Va因子和磷脂活化而得，经SDS-PAGE检测确保凝血酶原的完全活化，并以NIH凝血酶的标准品为参考，提供的酶活力不少于2700 NIH U/mg。

α-凝血酶（α-Thrombin）是一种高度特异性的丝氨酸蛋白酶，由凝血酶原（prothrombin，II因子）经蛋白水解活化而来。它在凝血过程中起着非常重要的作用，不仅能够促使纤维蛋白凝块的产生，还负责提供反馈信号来激活前辅因子：V因子和VIII因子。也可以激活XIII因子和血小板，或者用作血管收缩剂。

在体内，活化的X因子（Factor Xa）切割凝血酶原，释放出活性肽并将凝血酶切割成具有催化活性的α-凝血酶。α-凝血酶由一条轻链（A chain）（Mw ~6,000）和一条重链（B chain）（Mw ~31,000）通过二硫键连接而成。某些情况下，α-凝血酶会发生自溶生成β-凝血酶和γ-凝血酶。β-凝血酶由对α-凝血酶A链水解并切割含有B链糖基化位点的小片段（B1，B2）组合而成。

除了用于凝血研究之外，α-凝血酶还常用来位点特异性切割融合蛋白。基因重组时将凝血酶识别位点插入在目的蛋白与利于后续纯化和/或表达的多肽或者蛋白之间，通过凝血酶切割表达的重组子即可释放目的蛋白。凝血酶本身可通过亲和层析技术快速去除。

中文别名：α-凝血酶；IIa 因子；
英文别名：α-Thrombin; Factor IIa;
CAS：9002-04-4
分子量：37000 daltons
活力（Activity）：≥2700.00 NIH U/mg
缓冲液组分：50mM Sodium Citrate/0.2 M NaCl/0.1% PEG-8000/pH 6.5
消光系数（Extinction coefficient）（1%）：18.3

储存条件：≤-60℃

除了人α-凝血酶,,IIa 因子,α-凝血酶，我公司还供应以下相关产品：



名称：辛甲基硫吡喃葡萄糖苷(OTG)
货号：BTN131045
规格：5g
OTG全名是1-s- 辛基-β-D-硫吡喃葡萄糖苷)，它是一种广泛用于溶解膜蛋白的非离子型去垢剂。已发现在一些生物系统中，该产品不受β 半乳糖苷酶的影响。光学上透明并且可透析。与辛甲基β 葡糖苷的溶解能力相同，但稳定性更好。

储存条件：常温运输和保存，有效期一年。

名称：改良Lowry法蛋白定量试剂盒
货号：BTN101102
规格：1000次
 Folin酚试剂(磷钼酸和磷钨酸混合物)跟蛋白质中含酚氨基酸(色氨酸和酪氨酸)发生颜色反应，可用于测定蛋白质浓度，但灵敏度较低。Lowry在此基础上加入Biuret(双缩脲)反应步骤，即先在碱性条件下使蛋白质和Cu+形成复合物，再使其与Folin酚试剂发生显色反应，产物在750nm检测。
 Lowry法使不含酚的蛋白质也能被检测出来，灵敏度是单独使用Folin酚的10倍左右，是双缩脲反应的200倍，因此成为早期检测蛋白浓度的主要方法。传统Lowry法受到很多常用的试剂(如DTT、糖、甘油、Triton等)干扰，步骤繁琐。本公司对Lowry法进行改良。
 Lowry检测原理图如下：


产品特点：
1．即开即用，不需要单独购买每个成分再配制。
2．能抵抗部分干扰物(如一定浓度SDS或其他去污剂)的干扰。
3．检测线性范围广，在2-100μg，检测上限比经典Lowry法高30%-40%。

试剂盒组成：

成分	规格
溶液A成分一	208ml
溶液A成分二	16ml
溶液A成分三	16ml
溶液B	80ml
溶液C	80ml
福林酚	10mL(用100mL 棕色瓶)
BSA标准品(2mg/mL in水)	1ml
说明书	1份

储存条件：常温运输和保存(但BSA 标准品需要-20℃保存)，有效期一年。

使用方法：

一、准备工作
1．制备溶液A：将16mL溶液A成分二和16mL溶液A成分三加入到装溶液A成分一的塑料瓶中，混合均匀得到240mL溶液A。注意：溶液A各成分分开提供更加稳定。
2．制备 Lowry工作液：将溶液A、溶液B和溶液C按3：1：1的体积比混合得到Lowry工作液。此工作液可以室温放置2-3周，所以最好用多少配多少。如果发现溶液B或溶液C有沉淀，需37℃溶解并摇匀后再使用。
3．制备福林酚工作液：在装有10mL 福林酚的棕色塑料瓶中加入90mL 去离子水，摇晃混匀待用。此工作液在避光条件下可以放置6个月。

二、试管法
4．先用去离子水将BSA 标准(2mg/mL)稀释到50μg/mL，然后在标记的试管中加入下列成分(单位：μL)。注意：每个样品最好做三个稀释度，每个稀释度最好设置三次重复，阴性对照和标准品也最好做三次重复。

标准品(每个做三次重复，此处只列出一个)
编号	BSA 标准(50μg/mL)	水	总体积
阴性对照	0	0	200
1	0	200	200
2	25	175	200
3	50	150	200
4	100	100	200
5	150	50	200
6	200	0	200

 

样品(以1个样品、3个稀释度为例，每个稀释度三个重复，此处只列出一个)
编号	样品	总体积
1	200(稀释度1)	200
阴性对照1	200(用稀释度1稀释的溶解蛋白样品的缓冲液)	200
2	200(稀释度2)	200
阴性对照2	200(用稀释度2稀释的溶解蛋白样品的缓冲液)	200
3	200(稀释度3)	200
阴性对照3	200(用稀释度3稀释的溶解蛋白样品的缓冲液)	200

5．每管中加入200μl Lowry工作液，振荡混匀后室温反应10分钟。
6．每管中加入100μl 福林酚工作液，振荡混匀后室温反应30分钟。
7．用容量为0.5mL、光径为1 cm的玻璃比色杯或聚苯乙*(代"烯")比色杯测定750nm的光吸收。测定时，先空白(即阴性对照)后样品，测定样品和BSA标准品时，先低浓度后高浓度。测定未知样品前需要将杯子清洗干净，必要时可以用甲*清洗吸附到比色杯壁上的染料。
8．根据标准品三个重复的平均值绘制标准曲线，然后根据未知样品的光吸收从标准曲线中查得其对应的浓度。

三、96微孔板法
9．同上，只是反应用96 微孔板设置，用酶标测试仪750nm 测定光吸收。

四、样品中干扰物质的去除(本产品不含相关产品，如果样品中有干扰Lowry法蛋白定量的物质(见附表)，可另购本公司的微量蛋白质沉淀试剂盒(BTN81217)去除，也可以用自备试剂按下法去除：用水将样品调到体积为200μl，加入20μl 0.15%去氧胆酸钠，混匀，室温放置10分钟。加入20μL 72%的TCA，室温放置5分钟。3000 g离心15分钟，小心去除上清。用200μl水溶解蛋白沉淀后以用于Lowry法测定。
附：常见Lowry法蛋白定量干扰物(低于所列浓度不干扰，高于所列浓度则会干扰，需要按上法去除。不能含任何浓度的DTE，DTT和硫酸胺)。

干扰物	浓度	干扰物	浓度
Acetone	10%	2-Mercaptoethanol	1mM
Aprotinin	10mg/mL	NaCl	1 M
CHAPS	0.05%	NaOH	100mM
DMF	10%	NaPi	100mM
DMSO	10%	NP40	0.02%
EDTA	1mM	PMSF	1mM
EGTA	1mM	SDS	1%
Ethanol	10%	Sodium Citrate	100mM
Glucose	100mM	Sucrose	7%
Glycin	100mM	Tris	10mM
HEPES	1mM	Trition X-100	0.03%
Imidazole	25mM	Tween 20	0.05%
Methanol	10%	Urea	3M

疑难解答：
1. 该方法检测的蛋白质浓度范围1μg～50μg/ml。
2. 由于Lowry法测定的是蛋白质中酪氨酸残基，对于那些酪氨酸残基数高于或低于BSA,其测定的蛋白质含量将偏低或偏高。如果遇到该情况，需要采用BCA或Bradford法测定。
3. 阅读测定方法后化学试剂对测定方法的影响。