BJ5183电击感受态细胞

特别提示：包括BJ5183电击感受态细胞在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：BJ5183电击感受态细胞
英文名称：BJ5183 Electroporation-Competent Cell

产品货号：BJ5183电击感受态细胞
产品规格：5×50μl/20×50μl

BJ5183是一种具有较高重组活力的大肠杆菌菌株，是目前腺病毒系统最常用的感受态细胞。
BJ5183菌株含有sbcBCrecBC双重突变，赋予BJ5183细胞较强的重组能力，有利于转入的目的基因与腺病毒质粒{pAdeasy-1[encodes the Adenovirus-5 genome(E1/E3 deleted)]或pAdeasy-2[encodes the Adenovirus-5 genome(E1/E3/E4 deleted)]}的重组。endA1(缺失核酸内切酶)的突变有利于重组DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。Strr赋予BJ5183菌株链霉素抗性。
BJ5183电击感受态细胞适用于普通质粒和大质粒的构建，经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率>1010cfu/μg DNA。
保存条件：-80℃
基因型：
endA1sbcBCrecBCgalKmet thi-1bioThsdR(Strr)
操作说明：
1.0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。
2.取-80℃保存的BJ5183电击感受态细胞插入冰中5分钟，待其融化，加入目的DNA(质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。
A.测定转化效率使用1 μl 10 pg/μl的对照质粒pUC19；
B.对于连接产物，请用乙醇沉淀DNA后加入适量TE缓冲液(10 mM Tris HCl，pH7.5;1 mM EDTA)重悬，DNA浓度不超过100 ng/μl，体积不超过5 μl/50 μl感受态。
3.用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中，避免产生气泡，盖上杯盖。
4.启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV(此为BioRad电转仪推荐参数，也可按所用电转仪推荐的参数操作)，将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中。
5.2分钟后从冰中取出电击杯，放室温，加入700 μl不含抗生素的无菌S.O.C.培养基(室温)，用1ml枪吹吸电击杯底部数次混匀后，转移到50 ml离心管(BD Falcon 50 ml锥形离心管等)，向离心管中补加S.O.C.培养基至10ml。37℃，225 rpm复苏60分钟。
6.5000 rpm离心一分钟收菌，重悬后取100-200μl涂布到含相应抗生素的S.O.C平板上(因菌量较大，若全部涂板请选用直径15cm培养皿2-5个)。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
注意事项：
1.加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10。
2.电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。
3.当DNA不纯或存在盐，乙醇，蛋白及缓冲液等污染时，转化效率急剧下降。
4.电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。
5.若转化大质粒或想获得较高转化效率，推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
6.对于连接产物转化，最好转化前乙醇沉淀DNA后用适量TE缓冲液(10 mM Tris HCl，pH7.5;1 mM EDTA)重悬产物，保证 DNA浓度不超过100ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率，增加弧光放电的风险。
7.混入质粒时应轻柔操作，吸取感受态细胞时避免用力过猛，以免剪切力过大损伤细胞膜，降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。
8.电击感受态细胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。

除了BJ5183电击感受态细胞,，我公司还供应以下相关产品：



名称：单细胞裂解液(DNA提取)
货号：BTN130803
规格：1mL
本产品为单细胞DNA提取专用裂解液，本裂解液经多次优化，含有多种去污剂、变性剂和盐，可有效抑制核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏，维持核酸结构的稳定。纯化所得DNA可用于全基因组扩增(WGA)等实验。本产品足够使用200次以上。

储存条件：低温运输，4℃保存，有效期两年。

名称：pUCm-T载体
货号：BTN160101
规格：1μg
本产品是一种高效克隆PCR产物(TA Cloning)的专用载体。本载体由pUC系列载体改造而成，在pUC载体的多克隆位点处插入特殊的限制性内切酶识别位点，酶切后能在载体的3′端形成悬挂的“T”末端。很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA 每条链的3′端加上一个突出的碱基A。这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT 配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到，pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。可以通过蓝白斑筛选有插入片断的重组克隆，大大提高了3′末端A 突出PCR产物的连接、克隆效率。本产品应用于进行TA 克隆，克隆PCR产物。对克隆后的PCR产物可以用M13通用引物进行DNA 测序。

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一. 实验准备
1. PCR产物3′末端带有突出的A碱基：Taq、Tth、Ampli Taq、Klen Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物3′末端均带有突出的A碱基。建议扩增的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行回收，再进行连接转化实验。
2. PCR产物3′末端没有突出的A碱基：Pfu、Pwo、Tli或DeepVent等DNA聚合酶具有3′5′外切酶活性，其扩增的PCR产物末端可能不带有3′A，要对这种平末端PCR产物进行克隆，应先对其进行3′末端加A，再进行连接转化实验。

二.连接反应
3.在一个标准的10mL连接反应体系中，加入下列成分：

反应组分	10μl反应体系
插入的目的片段	xμL(0.2 pmol)
本产品	1μL(50 ng)
10×连接酶缓冲液	1μL
T4 DNA连接酶	3-5 U
补水到	10 L

 注意:一般最后加入T4 DNA连接酶。
4. 用移液器吹打反应混合液使之混匀后，16-23℃连接1～12小时(或按T4 DNA连接酶供货商提供的操作手册进行连接)。

三．细菌转化和鉴定
5. 将100μl感受态细胞置于冰上解冻后，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮。
6. 加入上述5μl连接液，轻轻混匀，冰上放置30分钟。
7. 42℃水浴热激90秒，再冰上放置15～20分钟。
8. 加入400μl自备的SOC培养基，37℃ 200～250rpm振荡培养1小时。
9. 4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400μl上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮。
10. 将细菌悬液均匀涂布在含20μl的IPTG(100mM)和100μl的X-gal(20mg/mL)的氨苄青霉素抗性的自备的LB平板上。(涂布菌液的用量可以根据连接的效率及感受态细胞的转化效率而进行适当的调整。)
11. 将平板于37℃培养1小时，然后倒置培养过夜。(先将平板正向放置1小时，以吸收过多的液体。)

四．筛选
12.转化子的蓝白筛选：
 当外源DNA片段插入到pUCm-T载体中后，由于外源DNA的核酸序列存在改变了LacZ基因的编码，从而影响了其产物β-半乳糖苷酶α-片段的活性，因此重组克隆在-gal/IPTG 平板上呈现为白色，而非重组克隆呈蓝色。选择在IPTG/X-gal 平板上生长的白色菌落，用牙签挑至含氨苄青霉素的液体培养基，37℃培养过夜。
13.转化子的鉴定：
1)用上述培养的白色菌落的菌液抽提质粒，用PstI单酶切或用其它合适的酶切,琼脂糖凝胶电泳检查片段大小，确定是否含有目的片段。
2)用M13通用引物或其它合适的引物直接进行测序来确定是否含有目的克隆。

操作提示：
1. PCR产物的纯度：
 连接反应前需用琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物，如果电泳检测PCR产物条带弥散，或出现非特异条带，则需要切下目的条带，用胶回收试剂盒对目的片段进行回收。若PCR产物电泳检测只有预期大小的明显条带，也应使用PCR产物纯化试剂盒直接纯化PCR产物，以除去引物二聚体。不经纯化的PCR产物在某些条件下可直接用于连接，但由于引物二聚体和PCR产物中其它物质的影响，造成含有插入片段的阳性克隆数减少，因而需要筛选很多克隆方可得到含有目的PCR产物的阳性克隆。
2. 平端PCR产物
 具有校正活性的热稳定性DNA聚合酶如Pfu、Pwo、Tli在进行PCR扩增时产生平端PCR产物。这种平端PCR产物可以进行3′末端加A 尾后连接到pUCm-T载体中，采用这种方法进行连接，可大大提高克隆的效率。
3.优化插入片段和载体的摩尔比
1)pUCm-T载体优化的插入DNA片段和载体的摩尔比为3:1，采用3-10:1的连接比例也可成功进行连接。如果你的PCR产物开始连接的不理想，则有必要优化连接比例。
2)PCR产物的量可采用以下公式进行换算：
PCR片段的量(ng)= [加入载体的量(ng)×插入片段大小(kb)/载体大小(kb)]×插入片段和载体的摩尔比
4.筛选含插入片段的转化子
插入片段成功克隆到pUCm-T载体中，可阻断β-半乳糖苷酶的编码序列，因而重组克隆可在指示培养基上通过颜色进行筛选。大多数情况下含有PCR产物的克隆菌为白色，如果PCR片段和LacZ基因在同一读码框内，即PCR片段碱基数是3的整数倍(含3′-A)，并且读码框无终止密码子，则重组克隆菌可能为蓝色。

质粒图谱：