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- 上海烜雅
- XY-TW-1002
- 国产/进口
- 2025年07月16日
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- 详细信息
- 询价记录
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
100
- 检测方法：
ELISA
- 供应商：
上海烜雅生物科技有限公司
- 规格：
100T
一、试剂盒说明
TUNEL 细胞凋亡原位检测试剂盒说明书。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素FITC标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
本试剂盒可应用于培养细胞凋亡检测（不推荐用于检测组织样本）。
二、试剂盒组份
| 组份 | (10 assays) | (20 assays) | (50 assays) | (100 assays) | 储存条件 |
| AnnexinV-FITC | 50 μL | 100 μL | 250μL | 500 μL | -20℃避光 |
| Propidium Iodide | 50 μL | 100 μL | 250μL | 500 μL | 4℃避光 |
| Binding Buffer | 5.0 mL | 10.0 mL | 25 mL | 50 mL | 4℃ |
2、Propidium Iodide和Binding Buffer组份不用时可放置于4℃保存，Propidium Iodide需要避光。
三、试剂盒以外自备仪器和试剂
流式细胞仪或荧光显微镜、低速离心机、微量移液器
1.5m L Microtube、载玻片、盖玻片（荧光显微镜观察需用）、PBS、不含EDTA的胰酶消化液
四、使用注意事项
- 微量试剂取用前请离心集液。
- Annexin V-FITC，Propidium Iodide （PI）避光保存及使用。对于Annexin V-FITC这个组份，建议您在收到产品之后，分装为小份避光保存于-20℃，即用即取。
- Propidium Iodide（PI）有毒，操作时要戴手套。
- 本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不以应低于1×105，不推荐用于检测组织样本。
- 推荐使用悬浮培养细胞。如果是贴壁细胞，需用不含EDTA的胰酶消化，如消化不当，可能引起假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含2%BSA的PBS中，防止进一步的损伤。
- 细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。
- 因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。
- 悬浮细胞离心（2000rpm离心5min）收集；贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集（注：胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性）；
- 用PBS洗涤细胞二次（2000rpm离心5min）收集1~5×105细胞；
- 加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞；
- 加入5μL Annexin V-FITC混匀后，加入5 μL Propidium Iodide，混匀；
- 室温、避光、反应5～15min；
- 请在1 hour内，进行下述荧光显微镜或流式细胞仪的观察和检测。
- 滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞；
- 对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡；
② 用PBS洗涤细胞两次；
③ 在500μL 的Binding Buffer中加入5μL Annexin V-FITC，5 μL Propidium Iodide，混匀；
④ 将上述溶液滴加于盖玻片表面，使盖玻片表面均匀覆盖；
⑤ 避光、室温反应5 min。
⑥ 将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下、双色滤光片（FITC和罗丹明）观察。Annexin V-FITC荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色。
B．流式细胞仪分析
- 用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488 nm; 发射波长Em=530 nm。
- Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道（FL1）检测；PI红色荧光（流式Ex=488nm,Em≥630nm）通过FL2或FL3通道检测，建议使用FL3。
- 荧光补偿调节：使用经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。
六、 实验范例
用凋亡诱导剂诱导P388细胞凋亡，在37oC，5%CO2培养箱培养4～6h后，参照说明书的操作方法进行检测，经流式细胞仪检测结果见下图。
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文献和实验ziweihua 求助高人啊，我想用斑马鱼整体胚胎检测其细胞凋亡情况，选用的Roche的in situ cell death detection kit, POD. 按照其中的贴壁细胞或细胞涂片的方法做了两遍，可是连阳性对照都没有信号。后来查找到一篇论文中的方法，如下： a，收集胚胎后用PBS清洗，转移到1.5ml的EP管内，4%多聚甲醛PBS固定过 夜 b，用PBS配制 25%50%75%的梯度酒精，每次5min将胚胎梯度脱水。
的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。由此，TUNEL成为了检测DNA片段化(细胞凋亡)的最常用方法。(以TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒(增强型，绿色荧光)为例) TUNEL检测：使用20 U/ml Dnase处理Hela细胞10分钟。 二、TUNEL实验中关键步骤 1. 充分脱蜡和水化。脱蜡前可先将切片在 60ºC烤片 20 min，再使用二甲苯脱蜡2次，每次 5-10 min;而水化一般建议用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，便于后期试剂能充分、均匀的结合反应
细胞仪检测。 二、荧光显微镜原位检测 注：本方法优点是可以原位观察细胞凋亡，缺点是部分凋亡由于贴壁不牢而检测不到。 如果条件可以，在诱导凋亡后，用多孔板离心机300 g离心5 min。 吸除细胞培养液，用PBS洗涤两次（如果条件允许，在此前做步骤A）。 离心后弃上清，加入500 μL稀释成1 × 的Annexin V Binding Buffer工作液。 加入5 μL的荧光素标记-Annexin V和5μL的细胞核染色液。 移液器轻轻混匀，室温避光孵育15~20 min。 Annexin V Binding
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