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        【求助】斑马鱼原位细胞凋亡检测怎么做啊?

        丁香园论坛

        2919
        求助高人啊,我想用斑马鱼整体胚胎检测其细胞凋亡情况,选用的Roche的in situ cell death detection kit, POD. 按照其中的贴壁细胞或细胞涂片的方法做了两遍,可是连阳性对照都没有信号。后来查找到一篇论文中的方法,如下:
        a,收集胚胎后用PBS清洗,转移到1.5ml的EP管内,4%多聚甲醛PBS固定过

        b,用PBS配制 25%50%75%的梯度酒精,每次5min将胚胎梯度脱水。
        c,用-20度预冷的丙酮冷冻固定10分钟
        d,PBS清洗 10minX2
        e,用新鲜配制的通透液(含0.1%的Triton X-100和0.1%的柠檬酸钠溶液)
        室温通透15min。
        f,PBS清洗 10minX2
        g. 阳性对照组加入DNase I 40ul(1u/ul),37度孵育15min
        h. PBS清洗 10minX2
        i. Roehe试剂盒中的的TUNEL反应缓冲液(含FITC标记的dUTP)和脱氧核糖
        核酸末端转移酶在冰上混合后加入。
        j. 4度孵育过夜后放37度30min
        k. PBS清洗终止反应,荧光显微镜观察。
        可是还是连阳性对照都没有信号。
        请问,哪位做过,指点一下吧,谢谢。
        或者发到我的邮箱:weiwangsky@hotmail.com
        首先,我不是高人没有搞过凋亡研究。

        不过,我提醒你一句,商业化的凋亡试剂盒一般都是针对特定阶段。例如,针对细胞膜变化、Caspase酶活性、针对线粒体状态等等。你首先应该看看你选择的POD试剂盒是否满足你的需求(比如凋亡处在什么阶段)。

        另外,看看试剂盒的说明书,例如,有的提示:“有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全,以及细胞外的矩阵成分阻止TdT进入胞内反应,进而产生假阴性结果。”导致TUNEL测定得不到结果。
        我也做了这个实验,发现整个斑马鱼都是荧光氯
        我觉得你的实验方法上没有问题,我也用过ROCHE的试剂盒,没有问题,就是用荧光感觉背景很深,整个胚胎都有荧光。

        本文由丁香园论坛提供,想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你,都可以成为师兄的好伙伴

        师兄微信号:shixiongcoming

        【求助】斑马鱼原位细胞凋亡检测怎么做啊?

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