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文献和实验的序列就好了。 无缝克隆技术应运而生 通过引物在目标片段两端添加一小段跟载体两端同源的序列，扩增得到的目标片段和线性化载体对应的末端同源，用特定外切核酸酶消化末端数个碱基得到粘末端，就能互补结合——全程不会加入额外的碱基！ 几家克隆技术领先的公司先后推出了基于同源序列的无缝组装克隆技术，取代内切酶甚至连接酶，能够实现在任意载体的任意位置无缝（无痕）插入任意长度的目标片段——任意大小、任意 GC 含量、甚至内部重复序列结构，统统都能实现精确的正向无缝克隆——没有插入方向的困扰，没有找酶切位点对眼神的繁琐，基本能避免
加热灭活酶。通过凝胶提取试剂盒纯化消化的pET-32α（+）载体骨架和从pMD18-T载体切下的基因片段。用T4 DNA连接酶在23℃下用pET-32α（+）载体骨架连接基因片段1小时，载体末端和插入末端的比例为1：3（fmol）。将10μl连接反应与100μl感受态大肠杆菌 BL21（DE3）在冰上混合10分钟，并将混合物在42℃下孵育90秒。加入800μlLB并在37°C下孵育40分钟。涂在含有100μg/ ml氨苄青霉素的LB平板上。在37°C孵育过夜。通过菌落PCR筛选插入物的存在或制备
刚性结构的15肽序列(Gly4Ser)3。 在单链抗体的构建中，其C末端可引入His尾、c-yc尾和脂类标签等，以有利于表达产物的检测和纯化。引入亮氨酸拉链、半胱氨酸以及a螺旋等结构，可用于构建双价单链抗体。单链抗体基因与蛋白A、毒素及其他蛋白基因的连接，可构建成具有新功能的杂合抗体基因。用于制备供免疫分析、影像诊断及治疗用的基因工程抗体制剂。 单链抗体的构建可以分为二部分：①抗体分子VH和VL基因的扩增、克隆和测序；②将经过测序验证的VH和VL基因插入单链抗体表达载体(见
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