样品实验方案
简要概述
- 用5×105至1×106cell/ mL的密度制备含测试化合物的细胞
- 用70%乙醇固定细胞
- 将0.5 µL 100X Nuclear Red CCS1和5 µL RNase A加入0.5 mL细胞溶液中
- 在室温下孵育30-60分钟
- 使用带有FL2通道的流式细胞仪分析细胞
实验步骤
1.用测试化合物处理细胞,以诱导凋亡或其他细胞周期功能。
2.对于每个样品,用0.5 mL PBS制备细胞,密度为5×105至1×106细胞/ mL。
2.1对于贴壁细胞:将细胞用胰蛋白酶消化,悬浮在10%FBS培养基中,离心(1000 rpm,5分钟),然后将沉淀重悬于PBS中。
2.2对于悬浮细胞:将细胞离心(1000 rpm,5分钟),并将沉淀物悬浮在PBS(1 mL)中。 注意:应单独评估每种细胞系,以确定诱导凋亡的最佳细胞密度。
3.用70%乙醇固定细胞:
3.1将0.5 mL细胞悬液吸移至1.2 mL无水乙醇中(最终浓度约为70%)。
3.2在冰上孵育细胞至少2小时(或在-20°C过夜)。在染色之前,细胞可以在-20°C下保存2年。注意:在用单克隆抗体染色细胞表面抗原后,通常将乙醇用于固定,而在用单克隆抗体染色细胞内抗原后,通常将甲醇用于固定。在此过程中,将固定并分析整个细胞。由于仍然存在整个细胞团,因此通常包括使用RNase来消除任何双链RNA。尽管已经对整个细胞进行了分析,但尝试检测与DNA结合的某些细胞内抗原的尝试可能会失败,因为蛋白质会从透化的细胞中漏出(例如绿色荧光蛋白)。在这些情况下,在酒精固定之前,用PBS中的1%低聚甲醛进行短暂的预固定(在4-6°C下10分钟),将有助于将蛋白质保留在细胞中。
4.用Nuclear Red CCS1染色细胞:
4.1以1000 rpm的速度沉淀细胞5分钟,并用冷PBS至少洗涤一次。
4.2将沉淀物悬浮在0.5 mL测定缓冲液(组分C)中。
4.3加入5 µL 100X Nuclear Red CCS1(组分A)和5 µL 100X RNase A(组分B)。
4.4在室温下孵育细胞30至60分钟。 注意:适当的孵育时间取决于所用的单个细胞类型和细胞浓度。 优化每个实验的孵育时间。
4.5可选:将细胞以1000 rpm离心5分钟,然后将细胞重悬于0.5 mL检测缓冲液(组分B)或自备缓冲液中。
4.6使用FL2通道(Ex / Em = 490/620 nm),通过流式细胞仪检测荧光强度。
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