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上海研卉生物科技有限公司
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低温
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100T
我们的Cell Meter 检测试剂盒是一套用于检测细胞活力和增殖的工具。有多种参数可用于监测细胞活力和增殖。在正常细胞中，DNA密度根据细胞的生长，分裂，静止执行其正常功能而变化。细胞周期的进程受各种细胞周期调节因子之间复杂的相互作用控制。这些调节剂激活转录因子，该转录因子与DNA结合并开启或关闭导致细胞分裂的蛋白质的产生。这种调节级联中的任何失误都会导致异常细胞增殖，这是许多病理状况（例如肿瘤形成）的基础。活细胞研究的潜在应用是确定细胞DNA含量和细胞周期分布，以检测生长模式的变化，检测凋亡，评估肿瘤细胞的行为和抑制基因的机制。该特定试剂盒旨在使用Nuclear Red CCS1（固定细胞中的细胞周期染色剂）检测细胞周期进程和增殖。染料穿过透化的膜并插入细胞DNA中。试剂盒中提供的RNase降解RNA后，Nuclear Red CCS1的信号强度与DNA含量成正比。可以使用流式细胞仪（FL2通道）检测给定样品中处于G0 / G1，S和G2 / M期的细胞百分比，以及处于凋亡之前的sub-G1期的细胞百分比。
样品实验方案
简要概述
- 用5×105至1×106cell/ mL的密度制备含测试化合物的细胞
- 用70％乙醇固定细胞
- 将0.5 µL 100X Nuclear Red CCS1和5 µL RNase A加入0.5 mL细胞溶液中
- 在室温下孵育30-60分钟
- 使用带有FL2通道的流式细胞仪分析细胞
实验步骤
1.用测试化合物处理细胞，以诱导凋亡或其他细胞周期功能。
2.对于每个样品，用0.5 mL PBS制备细胞，密度为5×105至1×106细胞/ mL。
2.1对于贴壁细胞：将细胞用胰蛋白酶消化，悬浮在10％FBS培养基中，离心（1000 rpm，5分钟），然后将沉淀重悬于PBS中。
2.2对于悬浮细胞：将细胞离心（1000 rpm，5分钟），并将沉淀物悬浮在PBS（1 mL）中。 注意：应单独评估每种细胞系，以确定诱导凋亡的最佳细胞密度。
3.用70％乙醇固定细胞：
3.1将0.5 mL细胞悬液吸移至1.2 mL无水乙醇中（最终浓度约为70％）。
3.2在冰上孵育细胞至少2小时（或在-20°C过夜）。在染色之前，细胞可以在-20°C下保存2年。注意：在用单克隆抗体染色细胞表面抗原后，通常将乙醇用于固定，而在用单克隆抗体染色细胞内抗原后，通常将甲醇用于固定。在此过程中，将固定并分析整个细胞。由于仍然存在整个细胞团，因此通常包括使用RNase来消除任何双链RNA。尽管已经对整个细胞进行了分析，但尝试检测与DNA结合的某些细胞内抗原的尝试可能会失败，因为蛋白质会从透化的细胞中漏出（例如绿色荧光蛋白）。在这些情况下，在酒精固定之前，用PBS中的1％低聚甲醛进行短暂的预固定（在4-6°C下10分钟），将有助于将蛋白质保留在细胞中。
4.用Nuclear Red CCS1染色细胞：
4.1以1000 rpm的速度沉淀细胞5分钟，并用冷PBS至少洗涤一次。
4.2将沉淀物悬浮在0.5 mL测定缓冲液（组分C）中。
4.3加入5 µL 100X Nuclear Red CCS1（组分A）和5 µL 100X RNase A（组分B）。
4.4在室温下孵育细胞30至60分钟。 注意：适当的孵育时间取决于所用的单个细胞类型和细胞浓度。 优化每个实验的孵育时间。
4.5可选：将细胞以1000 rpm离心5分钟，然后将细胞重悬于0.5 mL检测缓冲液（组分B）或自备缓冲液中。
4.6使用FL2通道（Ex / Em = 490/620 nm），通过流式细胞仪检测荧光强度。
参考文献
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文献和实验染料的浓度，引起假去极化。荧光探针JC-1是一种阳离子型的亲脂性染料，能够自由穿过细胞膜，随细胞膜电位的变化而在膜两侧保持动态平衡。其特点是线粒体膜电位低时浓度低，主要以单体形式存在，488nm激发时最大发射波长为527nm，呈绿色荧光，胞浆相对线粒体为低电位，形成流式图中所有细胞FL1均为阳性；膜电位高时浓度高形成聚集体，488nm激发时的最大发射波长为590nm，红色荧光。活细胞线粒体膜电位高，线粒体内JC-1聚集体的浓度高，红色荧光很强，在流式图上表现为FL1和FL2双阳性，而凋亡细胞则大多
引言 在哺乳动物的早期发育过程中，胚胎干细胞 (ESC) 经历细胞分化并产生所有胚胎生殖层，这些层最终在成年生物体中分化为多种细胞类型。 ESC 的特点是具有难以置信的自我更新和增殖能力，由于间隙期（G1 和 G2）截短，因此其分裂周期较短。 在细胞分化过程中，会发生标志性的细胞事件： 细胞改变形态，生长至约为其原有大小的十倍，并改变细胞核与细胞质的比率，同时细胞变得扁平和拉长； 命运特异性基因表达程序被激活，并发生全局染色质修饰。 重要的是，细胞周期减慢。 分化的体细胞具有较长的G1期和G2
xiehechen 求详细关于检测细胞周期的流式细胞技术步骤 谢谢各位 xiayuxue 期待中！ sdjlmu Procedures of DNA Flow Cytometry (Cell Cycle Analysis) ? Cell pellet (2-5X105 cells/sample) ? Resuspend and fix cells
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