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        流式细胞检测线粒体膜电位

        互联网

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        线粒体跨膜电位DYmt的下降,被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件,它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前,一旦线粒体DYmt崩溃,则细胞凋亡不可逆转。  

        线粒体跨膜电位的存在,使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine 123、3,3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6(3)]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可结合到线粒体基质,其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。  

        一、方法

        将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine 123(1mM)或终浓度为DiOC6(25nM),JC-1(1mM),TMRM(100nM),37°C平衡30min,流式细胞计检测细胞的荧光强度。  

        二、注意事项

        1、始终保持平衡染液中pH值的一致性,因为pH值的变化将影响膜电位。  

        2、与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白,他们将与部分染料结合,降低染料的浓度,引起假去极化。

        荧光探针JC-1是一种阳离子型的亲脂性染料,能够自由穿过细胞膜,随细胞膜电位的变化而在膜两侧保持动态平衡。其特点是线粒体膜电位低时浓度低,主要以单体形式存在,488nm激发时最大发射波长为527nm,呈绿色荧光,胞浆相对线粒体为低电位,形成流式图中所有细胞FL1均为阳性;膜电位高时浓度高形成聚集体,488nm激发时的最大发射波长为590nm,红色荧光。活细胞线粒体膜电位高,线粒体内JC-1聚集体的浓度高,红色荧光很强,在流式图上表现为FL1和FL2双阳性,而凋亡细胞则大多为FL1单阳性。

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