细胞凋亡检测试剂盒I(POD)

特别提示：包括细胞凋亡检测试剂盒I(POD)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：细胞凋亡检测试剂盒I(POD)
产品规格：20T

保存条件：-20℃冰冻保存。
保存期：一年
工作原理：
在机体内部随时都在发生着细胞的死亡。传统上用显微镜来观察细胞的死亡，其特征为核染色质的浓缩及碎片的形成。但是这种现象出现的很晚，时间也很短暂。凋亡的特征是内源性核酸内切酶被激活，细胞自身的染色质或DNA被切割，出现单链或双链缺口，并产生与 DNA 断点数目相同的3’-OH末端。末端脱氧核糖核酸转移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase)可以将Digoxin标记的dUTP(DIG-dUTP)标记至 3’-OH末端，DIG-dUTP结合在DNA断点部位，可以通过生物标记的抗Digoxin抗体(Anti-DIG-Biotin)反应后，再结合链酶亲和素-过氧化物酶(SABC)，然后加入显色底物DAB予以显示。凋亡的细包核呈黄色，从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞。
试剂盒内容：
1．标记缓冲液(Labeling Buffer)1ml
2．末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT,×20)20μl
3．DIG-dUTP(×20)20μl
4．封闭液(Blocking Reagent)4ml
5．生物素化抗Digoxin抗体(× 100)20μl
6．SABC(× 100)20μl
7．Proteinase K(×200)50μl
8．抗体稀释液 4ml
阳性对照片 2 张
用户自备试剂：
1．多聚赖*酸或APES。
2．0.01M TBS,PH7.5(配法:1L 双蒸馏水中加入 8.5 克*化*,1.2 克 Tris和 0.45—0.5ml纯乙酸。)
3．DAB 显色试剂盒，也可自配显色剂。
操作步骤：
1．样品处理
(1)玻片预先用多聚赖*酸或APES 进行处理。
(2)细胞涂片和冰冻切片：最重要的是及时固定。用 4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0---7.6)室温下固定 30—60分钟。0.01M PBS洗2分钟×2次。蒸馏水洗涤 2分钟×2次。
(3)组织：有条件时应及时固定。常规 4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0---7.6)或10%中性缓冲福尔马林固定 4 小时以上，石蜡包埋。切片常规脱蜡入水(脱蜡务必干净)。
2．新鲜配制 3%H2O2，室温处理 10分钟。蒸馏水洗涤 2分钟×3次。
3．标本片加 0.01M TBS 1:200 新鲜稀释 Proteinase K 37℃消化 1—15分钟,0.01M TBS洗2分钟×3次。(细胞涂片和冰冻切片一般不消化或消化 10—60 秒钟。新鲜石蜡切片消化 5-10分钟。陈旧
石蜡切片消化 10-15分钟)。
4．标本片加标记缓冲液(Labeling Buffer)20μl/片,以保持切片湿润。按每张切片取 TdT和 DIG-d-UTP各1μl，加入 18μl标记缓冲液中，混匀。甩去切片上多余液体后加标记液，20μl/片。置样品
于湿盒中，37℃标记2 小时。
5．0.01M TBS洗2分钟×3次。
6．加封闭液 50μl/片，室温 30分钟，甩掉封闭液，不洗。
7．用抗体稀释液 1：100 稀释生物素化抗Digoxin抗体：(取 1ml 抗体稀释液加生物素化抗Digoxin抗体 10μl)，混匀后 50μl/片加至标本片上。置样品于湿盒中，37℃反应 30分钟。
0.01M TBS洗2分钟×3次。
8．用抗体稀释液 1：100 稀释 SABC：取 1ml 抗体稀释液加 SABC 10μl，混匀后 50μl/片加至切片。37℃反应 30分钟。0.01M TBS洗5分钟×4次。
9．DAB 显色：取 1ml 蒸馏水，分别加入 DAB 试剂盒中 A，B，C 试剂各一滴，混匀后
加至标本片上，显色 10-30分钟左右。水洗。
10．苏木素轻度复染。0.01M TBS洗，蒸馏水洗。脱水，透明，封片。显微镜观察。
结果判定：
细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞。
注意事项：
1.试剂盒严格-20℃存放。
2.初用时如试管底部无可见的试剂，在离心机离心 5分钟，使试剂沉至管底。
3.检测过程中切勿使样品干涸。