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- KA&M-BIO
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- GJ50433
- 2025年09月14日
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- 文献和实验
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- 保存条件：
常温避光
- 保质期：
长期
- 库存：
9999
- 供应商：
上海圻明生物
- 规格：
g
产品仅供科研，不用于临床。
MTT溶液的配制方法
通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。 需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.
配制MTT时用PBS（ph=7.4）溶解。PBS配方：Nacl 8g ＋ Kcl 0.2g ＋ Na2HPO4 1.44g ＋ KH2PO4 0.24g调pH 7.4,定容1L。
普通MTT法实验步骤：
1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.
2: 培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。
3：呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20ul.继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。
4：比色：选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
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有多少种不同稀释浓度。通常，一种或两种一抗的稀 释度是用两种或三种不同的二抗稀释度进行测定的。例如：1/1000 的一抗和1/50000 的二抗；1/1000 的一抗和1/100000 的二抗；1/5000 的一抗和1/50000 的二抗；以及1/5000 和1/100000 的二抗。 3. 将膜放在滤纸上。将抗原稀释液点在膜上。用尽可能小量的稀释液点在膜上（2-5 ul 为宜），因为用的体积越大，信号越弥散。抗原溶液在膜上干10-30 分钟或直至无可见的水分。 4. 用含0.05
重要。1.转膜时间2. 转膜过程环境温度3. 转膜缓冲液使用次数4．转膜缓冲液中甲醇比例（v/v）（三）一抗使用*使用IRS1（150kDa）、pPERK（125kDa）和内质网应激XBP1（29/55kDa）抗体等检测小鼠肝组织探讨一抗在多种条件下对结果影响（IRS1，pPERK和 XBP1 用于 WB 检测难以出现清晰条带，因此选择合适的一抗及孵育条件就很关键）。1.一抗稀释溶剂2.一抗稀释比例3.一抗孵育时间（四）二抗使用*高浓度的二抗会导致大量非特异性结合，造成WB背景较深。1.二抗稀释比例 （洗释
使用寿命（抗体并非绝对不可以冻融；只是高浓度的原始管抗体的冻融对效价会有较大影响）。抗体稀释液（一抗、二抗稀释液也可同也可不同）和封闭液可以相同，可以不同，因为抗体稀释液可以采用复方的，所以即使混合了少许，不会对抗体的使用产生较大的影响。不过封闭液用milk时，gelatin稀释的一抗混入少许milk会影响其使用寿命。由于以上诸多可变因素，实在无法总结出一种万金油式的抗体稀释液（只能是多数通用），因此对待具体问题时，请具体对待（多花点心思摸索吧）。
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