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- 2025年08月17日
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- 文献和实验
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文献和实验间接IM―PCR (以神经肽Y的检测为例) 【试剂与配制】 （1）TBS：20mmol/L Tris-HCl（pH7.4），150mmoI/L NaCL （2）封闭液：1.5％ BSA （用TBS配制） （3）抗神经肽Y单抗 （4）兔抗神经肽Y抗体 （5）生物素化羊抗兔IgG （6）亲合素 （7）DNA指示分子(生物素―AdAT) （8）PCR反应液：5×PCR缓冲液10μl，dNTP 4μl，引物4μl，EP-DNA聚合酶0.5μl,蒸馏水31.5μl
FITC标记的B抗体染色，根据两种抗体的动物种属不同，可用直接法也可用间接法，结果A抗原呈现橘红色荧光，而B抗原呈现黄绿色荧光。在应用中，常用的方法是免疫荧光组织化学中间接法和SABC-Cy3法相结合。例如，在实验设计时，选择小鼠抗大鼠A和兔抗大鼠B作为两种不同的特异性一抗，相匹配的二抗分别为FITC-抗小鼠IgG和生物素化―抗兔IgG。进行双重染色时，由于两种一抗种属来源不同，可把一抗混合使用。孵育结束后洗涤未结合的一抗，滴加二抗时，先加人生物素化―抗兔IgG(二抗)孵育，洗涤后，滴加SABC-Cy
DNA发生反应。然后用酶标羊(或兔)抗鼠IgG抗体及相应底物进行显色。使用这一方法,可检测出单个抗原分子。材料与试剂包括: ①所测物的单克隆抗体(鼠)；②所测物的多克隆抗体(兔)；③生物素化羊抗鼠IgG；④生物素化羊抗兔IgG；⑤生物素化dUTP；⑥Klenow聚合酶；⑦PCR反应液；⑧引物(自行设计)；⑨生物素化DNA标记分子。
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