限制性内切酶SphI 工具酶

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名称：限制性内切酶SphI 工具酶
编号：BTN17-0260
规格：500U
英文名：Sph I Restriction Endonuclease
品牌：百奥莱博
产地：北京
Sph I限制性内切酶识别位点：
5´...G　C A T G↓C...3´
3´...C↑G T A C　G...5´

产品组成：

 

成分	规格
SphI，10U/μL	50μL
Buffer A，10×	1mL
Buffer B，10×	1mL
使用手册	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

贮存Buffer：10mM potassiu*(代"m")-phosphate(pH7.0＠25℃)，50mM KCl，1mM DTT，0.1mM EDTA，0.15% Triton X-100，0.5mg/mL BSA and 50% glycerol。
1×Buffer A：10mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，0.1mg/mL BSA。
1×Buffer B：33mM Tris-acetate(pH7.9 at 37℃)，10mM magnesium acetate，66mM potassiu*(代"m") acetate，0.1mg/ml BSA。

活性定义：一个活性单位是指50μl反应体系中，37℃条件下，1小时内将1μg的lambda DNA完全分解所需的酶量。

热灭活：65℃下孵育20分钟可灭活。

使用方法：
1．单酶切DNA：
①在离心管中加入下列溶液：

成分	用量
Sph I	0.5-2μL
10×Buffer A	2μL
DNA(0.5-1μg/μL)	1μL
nuclease-free water	16L

②轻柔混匀，短暂离心。
③37℃孵育1-16小时。
2．双酶切或多酶切DNA：
需选择适当的可以兼容两个或多个内切酶的缓冲液(一般Buffer B可作为双酶切Buffer)，然后参考上表设置反应体系。如果没有合适的缓冲液可以选择，可以在一种酶消化完毕后进行纯化，纯化完毕后再进行另外一种酶切反应。
3．直接酶切PCR产品：
①在离心管中加入下列溶液：

成分	用量
PCR reaction mixture	10μL(~0.1-0.5μg of DNA)
nuclease-free water	18μL
10×Buffer A	2μL
Sph I	1-2μL

②轻柔混匀，短暂离心。
③37℃孵育1-16小时。

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限制性内切酶SphI 工具酶关键词：Sph I Restriction Endonuclease,限制性内切酶SphI,BTN17-0260

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限制性内切酶SphI 工具酶关键词：Sph I Restriction Endonuclease,限制性内切酶SphI,BTN17-0260


·酿酒酵母Y2HGold化学感受态细胞
编号：BTN140390
英文名称：E.coli Y2HGold Chemical Competent Cell
规格：10×100μL
 酿酒酵母Y2HGold是Clontech公司开发的GAL4系统酵母双杂实验用菌株，MATa型，可直接转化质粒或与MATα型酵母菌株Y187 通过mating 操作进行蛋白互作验证或筛库试验。Transformation marker 为：trp1，leu2，报告基因为：AbAr，HIS3，ADE2，MEL1。

 Y2HGold-GAL4酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：pGBKT7和pGADT7。质粒pGBKT7的筛选标志为TRP1，用于表达DNA-BD(来自酵母转录因子GAL4N 端1~174 位*基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白；质粒pGADT7的筛选标志为LEU，用于表达AD(GAL4 C 端768 ~881 位*基酸)与目标蛋白(Prey)的融合蛋白。

 GAL4系统原理：一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构域：位于N端1~174位*基酸区段的DNA结合域(DNA-BD)和位于C端768~881 位*基酸区段的转录激活域(AD)。DNA-BD能够识别GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS，并与之结合。而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD单独存在不能激活转录，但当二者接近时，则呈现完整的GAL4活性，使含有UAS的启动子下游基因转录表达。正常条件下，BD不与AD结合，将要检测的蛋白质分别与BD和AD融合，形成bait融合蛋白(bait-BD)和prey融合蛋白(prey-AD)，如果bait和prey发生相互作用，就会促使BD和AD的相互接近，形成完整的GAL4，从而激活报告基因的转录。Y2HGold有四个报告基因：AbAr，HIS3，ADE2，MEL1，分别由三种不同的启动子(G1，G2，M1)启动，这三种启动子只有GAL4识别的17bp核心区相同，其余部分均不同，大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。此外新报告基因AbAr与以前的营养缺陷报告基因相比具有更低背景的优点，也可以降低酵母双杂假阳性发生的概率。

 Y2HGold感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGADT7质粒检测转化效率>104cfu/μg DNA。

Y2Hgold的基因型是：MATa，trp1-901，leu2-3，112，ura3-52，his3-200，gal4Δ,gal80Δ，LYS2::GAL1UAS-Gal1TATA-His3，GAL2UAS-Gal2TATA-Ade2URA3::MEL1UAS-Mel1TATA AUR1-C MEL1

产品组成：

成分	规格
Y2Hgold感受态细胞	0.1ml×10支
PGADT7，10 ng/μL	10μl
Carrier DNA，5μg/μL	100μl
PEG/LiAc	5ml
说明书	1份

储存条件：感受态细胞干冰运输、-80℃保存，Carrier DNA -20℃保存；PEG/LiAc 4℃保存；有效期半年。

自备试剂：目的DNA、YPDA、 SD培养基等。

使用方法：
1. 取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100μl，可以根据实际情况分装使用。
以下实验以100μL感受态细胞为例。
2. 待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中依次加入2-5μg预冷的目的质粒、10μLCarrier DNA(95-100℃ 5分钟，快速冰浴，重复一次)、500μl PEG/LiAc，吹打混匀，30℃水浴30分钟(15分钟时翻转6-8次混匀)。
3. 42℃水浴15分钟(7.5分钟时翻转6-8次混匀)。
4. 5000rpm离心 40秒，弃上清。取400μl ddH2O 重悬沉淀，5000rpm离心 30秒，弃上清。
5. 取50μl ddH2O 重悬沉淀，涂板，29℃培养48-96小时。

注意事项：
1. 酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
2.菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine 被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成 Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine 合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P - ribosylamino imidazole(AIR)在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
3. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA 平板29℃，48h培养可见直径1mm 克隆；涂SD 单缺平板29℃，48-60h培养可见直径1mm 克隆，涂SD 双缺平板29℃，60-80h培养可见直径1mm 克隆，涂SD 三缺或四缺平板29℃，80-90h培养可见直径1mm 克隆。
4.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
5. 同时转化2-3 种质粒时可增加质粒的用量。

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