ZN1055型Oxytocin R mRNA原位杂交试剂盒现

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北京百奥莱博专业生产销*(代"售")ZN1055型Oxytocin R mRNA原位杂交试剂盒现货价格，我公司供应的分子生物学试剂品类齐全，且具有优势价格，欢迎新老客户垂询订购。

名称：ZN1055型Oxytocin R mRNA原位杂交试剂盒现货价格
规格：100T
产地：国产|进口
品牌：百奥莱博
基本信息：
保存条件：4℃保存一年
工作量：100张切片。
有效期：一年。
适用种属：mouse
标记方式：3’—尾段标记
试剂盒中内容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.预杂交液 2ml；
3.Oxytocin R mRNA原位杂交试剂盒寡核苷酸探针杂交液 2ml；
4.封闭液 5ml；
5.生物素化鼠抗地高*(代"辛") 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化过氧化物酶 5ml。
用户自备试剂：
原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位杂交用 PBS)
一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7•H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸馏水中加*化*17.6g，柠檬酸三*(C6H5O7Na3•2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
原位杂交用PBS(1000ml蒸馏水加*化*30g,Na2HPO4•12H2O 6g,NaH2PO4•2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：最重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖*酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖*酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗地高*(代"辛")：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲*透明，封片。
二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖*酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟,10分钟，20分钟，30分钟。以找到最佳的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。其余步骤和冰冻切片6-16步相同。
结果观察：
Oxytocin的细胞胞浆着色呈棕黄色。
注意事项：
由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的极少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—10倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。

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PBST(pH7.4)  1×|10× 500ml
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Hollande固定液   500ml
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·SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(变性)(1×)
编号：ZN1876
规格：10ml
产品保存：-20℃保存，一年有效
产品说明：SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(SDS-PAGE Sample Loading Buffer，1×)，是一种经过改良的以*酚蓝为染料的蛋白上样缓冲液。可以直接用于细胞或组织样品的裂解，并用于后续常规的SDS-PAGE 蛋白样品的上样。使用 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(1×)直接裂解蛋白样品的优点是比较便捷；缺点是裂解好的蛋白样品不能用常规的Bradford 法或 BCA 法测定蛋白浓度。这样蛋白上样量的均一性就较难控制，需要借助考马斯亮蓝等的染色结果或
Western的检测结果，来调整上样量。当细胞量或组织用量能控制得比较均一时，使用本裂解液直接裂解获取蛋白样品会比较便捷。
本产品也可以用于 SDS-PAGE 时待上样蛋白样品的稀释等。
注意事项：
1．SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(1×)中含少量 DTT，有轻微刺激性气味，但不含剧毒的巯基乙醇。
2.SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(1×)必须完全溶解后再使用。
使用说明：
1.在室温或不超过 37℃的水浴中溶解 SDS-PAGE 上样缓冲液(1×)。水浴溶解后立即室温存放，尽量避免长时间 置于水浴中。
2.对于贴壁细胞：去除培养液，用 PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。按照 6 孔板每孔加入 150-250 微升 SDS-PAGE 上样缓冲液(1×)的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使 SDS-PAGE 上样缓冲液(1×)和细胞充分接触。通常 SDS-PAGE 上样缓冲液
(1×)接触细胞 1-2 秒后，细胞就会被裂解。裂解后的样品收集到一洁净离心管内。
3.对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250微升SDS-PAGE上样缓冲液(1×)的比例加入 SDS-PAGE 上样缓冲液(1×)。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成 50-100 万细胞/管，然后再进行裂解。
4.对于组织样品：
A.把组织剪切成细小的碎片。
B.按照每 20 毫克组织加入 150-250 微升 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(1×)的比例加入 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(1×)。(如果裂解不充分可以适当添加更多的SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(1×)，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(1×)的用量。)
C.用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。
D.充分裂解后，将样品收集到一洁净离心管内。
说明：如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈 vortex 使样品裂解充分。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。
5.100℃或沸水浴加热 5-10分钟，以充分变性蛋白。说明：煮沸前通常会发现蛋白样品内有粘稠的半透明状物体，通常在本上样缓冲液内沸水浴煮沸 8-10分钟后可以确保该粘稠的半透明状物体消失，以便于后续的上样操作。
注意：如果起始时细胞或组织的用量较大，基因组 DNA 含量较高，煮沸 5-10分钟后有可能仍然比较粘稠或者有粘稠状的半透明物体。此时需要再煮沸 5-10分钟或者加入适量 1×的蛋白上样缓冲液后再煮沸 3-5分钟。充分煮沸后一方面可以使结合在基因组 DNA 上的蛋白充分释放，同时会导致基因组 DNA的部分断裂从而使粘稠感消失，这样就不会影响后续的上样操作了。
6.冷却到室温后，室温稍离心一下以沉淀可能出现的杂质等，上清即可直接上样到 SDS-PAGE 胶加样孔内即可。通常电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。


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