DNA快速连接试剂盒说明书

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。

百奥莱博专业生产销*(代"售")DNA快速连接试剂盒说明书，我公司供应的分子生物学试剂品类齐全，且具有优势价格，欢迎新老客户垂询订购。

名称：DNA快速连接试剂盒说明书
品牌：百奥莱博
产地：国产|进口
编号：BTN70602
规格：100次
 DNA连接反应通过T4连接酶催化双链DNA的3´-OH和5´-P形成磷酸二脂键而将DNA共价连接在一起。被连接的DNA末端可以是粘末端(例如限制性切割EcoR I产生的末端)，也可以是平末端(限制性切割Sma I产生的末端)。Pheiffer等人发现PEG可以促进T4 DNA连接酶催化的连接反应[NAR，11，7853-7871，1983]，连接反应只需十分钟即可完成。

产品特点：
1.超快，整个连接反应只需要室温5分钟左右，反应液可以直接用于转化实验。
2.高效，溶液配方经过优化，每ug 插入DNA连接转化得到的重组子可达107左右。
3. 既可用于平末端连接，也可用于粘末端连接，包括PCR产物与T载体的连接。
4. 简单，客户只需要提供载体和插入片段即可。

试剂盒组成：

 

成分	规格
溶液A	500μl
溶液B	100μl
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一：连接反应
1.在无菌的离心管中严格按下表顺序加入列各成分(以10μl 体系为例):

成分	阴性对照管	样品管
溶液A	5μl	5μl
插入片段(自备)	-	0.2-0.5μg(注)
载体(自备)	50ng	50ng
无菌水	补水到9μL	补水到9μL

 注：插入DNA片段的摩尔数最好是载体的3-10倍，如果载体长度为3000bp，则所需插入DNA片段折合成重量(ng)＝(插入DNA片段bp 数×50 ng×N)÷3000bp。N就是自己选定的插入DNA片段与载体的摩尔比。
2. 最后在每管中加入1μl溶液B，轻柔吹打混合均匀后用微量离心机将液体全部甩到管底。
3.室温放置至少5分钟，最长可以放置过夜。
4. 70℃保温10分钟。此步可以灭活有关的酶，否则转化效率有所降低。
5. 根据使用的转化方法，每管各取适量用于转化实验，余下的放置在-20℃保存。

二：细菌转化及筛选(仅供参考，本产品不提供相关试剂)
6. 将100μl转化效率在1×108 cfu/μg以上的感受态细胞于冰上解冻。
7. 取5-10μl连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以混匀。
8.在冰上放置30分钟。
9. 将离心管放42℃热休克90秒，然后快速将其转移到冰浴中放置1～2分钟。
10. 每管中加900μl LB培养基，37℃振荡培养1小时复苏细胞。
11. 将100μl 复苏涂布到含Amp的LB 琼脂平板上(根据载体情况也可能需要加上X-gal和IPTG)。
12.室温4,000rpm离心剩余的900μl 复苏细胞5分钟，弃去800μL上清，用剩余100μl培养基重悬细胞并涂布到含Amp的LB 琼脂平板上(可加X-gal、IPTG)。
13. 将平板置于室温直至液体被吸收。此步非常重要，否则培养板将在37℃排除水分，细菌将随水在培养基上到处游动，不能形成单个菌落。
14. 倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。一般情况下阳性对照组会有上千个菌落(100μl转化液产生的菌落数×10)，自联对照只有少数几个菌落，样品组的菌落数取决于PCR 回收片段的质量。
15. 按常规方法筛选重组子。

关于DNA快速连接试剂盒说明书的更详细说明，请致电我公司咨询，我们将以最饱满的热情为您提供解答，此外，我公司专业供应下列产品：

·抑*肽酶溶液(5mg/mL)
编号：BTN130536
英文名称：Bestatin Solution
规格：5mL
本产品为5mg/mL抑*酶的甲醇溶液，工作浓度为40μg/mL(130μM)。抑*肽酶(Bestatin)，又称*肽酶抑制剂、乌*美司(ubenimex)，分子量是308.4，是一种竞争性的蛋白酶抑制剂，可抑制*肽酶B、白*酸*基肽酶、三肽*肽酶和哺乳动物细胞表面的*基肽酶等蛋白酶的活性，不能抑制羧肽酶。

储存条件：低温 运输，-20℃保存，有效期一年。

·T7 RNA聚合酶
编号：BTN120310
英文名称：T7 RNA Polymerase
规格：1000U
T7 RNA聚合酶是一种高度特异识别T7启动子序列的DNA依赖的5´→3´RNA聚合酶，它可以催化单链或双链DNA T7启动子下游NTP的掺入，合成与T7启动子下游的模板DNA互补的RNA。

产品特点：
1．对于T7启动子有高度的特异性，用于体外RNA(含小RNA)的合成。
2．能识别修饰的NTP(生物素标记、地高*(代"辛")标记、荧光素标记的NTP)，可用于标记探针。
3．所得RNA可用于下列后续实验：核酸杂交、基因组DNA序列分析、核糖核酸酶保护测定、反义RNA合成，体外翻译，RNA剪接、RNA二级结构分析、RNA-蛋白质相互作用、核酸扩增、siRNA、miRNA等小RNA。

产品组成：

成分	规格
T7 RNA聚合酶(20U/μL)	50μl
5×反应缓冲液	250μl
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、制备DNA模板(本试剂盒不含所需试剂，此处信息仅供参考)
PCR片段和质粒DNA都可以用作体外转录的模板，但是必须注意以下几点。
⑴必须使用线性化的DNA。如果是质粒DNA，则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。
⑵ 需要转录的DNA序列的上游必须有T7启动子。如果模板是PCR产物，则可以在设计引物时将T7启动子序列(5´TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3´)加上。如果是将DNA片段克隆到载体上，则需要选择有T7启动子的载体，并且克隆位点必须位于T7启动子下游。
⑶ 需要转录的DNA序列的下游端最好不要是3´突出。如果是3´突出(比如选择了Pst I来线性化质粒)，则最好用T4 DNA聚合酶修平。
⑷必须保证DNA模板中没有RNase。由于提取质粒DNA的过程中一般要使用大量的RNase A，因此质粒DNA一般都有严重的RNase A污染，所以在用作模板前，最好采取胶回收得方法回收质粒DNA。并且加入少量总RNA一起保温，然后电泳检测RNA是否被降解，以此来判断纯化的DNA模板是否有残留RNase A。

二、体外转录反应(本试剂盒不含除酶和反应液之外的相关试剂)
1．在一个RNase-free的塑料离心管中，在室温下(不是在4℃下)按次序加入下列成分：

成分	加入量	备注
DNA模板		如果使用质粒DNA,必须反复酚-*仿抽提去除残留的RNase,然后再乙醇沉淀质粒DNA
PCR片段	50ng左右
质粒DNA	1μg左右
RNase抑制剂
5×反应缓冲液	4μl	需室温时使用
NTP(2.5mM each)	4μl
T7 RNA聚合酶	0.5-1μL
RNase-free水	补水到20μL

注：此为20μL反应体系的用量，对其他反应体系，各成分的用量可以按比例增减。如果需要标记RNA探针，则需要订购NTP分开的试剂盒。如果需要得到加帽RNA，则需要加入自备的加帽修饰核苷酸。
2．37℃保温1-2小时。
 注意：延长保温时间并不能提高产量。
3．70℃加热10分钟灭活T7 RNA聚合酶。
4．取1-3μL电泳检测转录效果。一般1μg DNA可以合成5-10μg的RNA。
5．得到的RNA可以放-80℃保存。

三、如果需要去除DNA模板(仅产品不提供所需试剂)
1．在体外转录体系中加入1μL自备的RNase-free DNase(3-5U/μL)。
2．37℃保温15-30分钟。
3．补水到100μL。
4．用自备的等体积(100μL)的Tris饱和酚-*仿抽提一次去除残留的DNase和RNA聚合酶。
5．加200μL微量核酸沉淀剂(用前需要摇晃混匀)，振荡后15000rpm离心3～5分钟，弃上清。
6．加入1mL 75%乙醇，震荡10秒后15000rpm离心3～5分钟，弃上清。
7．短暂离心数秒，用枪头吸弃上清。晾干，所得沉淀即体外转录所得的RNA。可溶于RNase-free水中后立即使用或放-80℃长期保存。


DNA快速连接试剂盒说明书关键词：BTN70602,Rapid DNA Ligation Kit,DNA快速连接试剂盒


·噻孢霉素溶液
编号：BTN120684
英文名称：Cefotaxime Solution
规格：1mL
本产品为浓度100mg/mL的噻孢霉素水溶液。参考浓度50mg/mL。噻孢霉素(头孢噻肟*)分子式为：C16H16N5NaO7S2，分子量：477.45，CAS号：64485-93-4。效价：916-964μg/mg，溶于水。噻孢霉素为β-半乳糖苷酶抑制型抗菌素，能抑制肽聚糖的交联，从而抑制细菌细胞壁合成，常用于植物组织培养中抑制农杆菌。

储存条件：低温运输，-20℃避光保存，有效期6个月。

·痰液采集器
编号：BTN130938
英文名称：Sputum collector
规格：1个
本产品为浓度100mg/mL的噻孢霉素水溶液。参考浓度50mg/mL。噻孢霉素(头孢噻肟*)分子式为：C16H16N5NaO7S2，分子量：477.45，CAS号：64485-93-4。效价：916-964μg/mg，溶于水。噻孢霉素为β-半乳糖苷酶抑制型抗菌素，能抑制肽聚糖的交联，从而抑制细菌细胞壁合成，常用于植物组织培养中抑制农杆菌。

储存条件：低温运输，-20℃避光保存，有效期6个月。

·KOD DNA聚合酶
编号：BTN101002
英文名称：KOD DNA Polymerase
规格：250U
KOD DNA Polymerase是从克隆有Thermococcus Kodakaraensis DNA聚合酶基因的质粒在大肠杆菌中经诱导表达分离纯化而来。该酶所具有的超强3´→ 5´外切酶活性使得其扩增保真性比Pfu DNA Polymerase更高，保真性是Taq的约50倍，同时具有合成速度快的特点，聚合速度约为普通Pfu DNA Polymerase的5倍，Taq DNA Polymerase的2倍，达到100-138bp/秒，可以在短时间内获得高产量的扩增产物，特别适合于高保真地扩增6 kb以内的PCR产物，扩增所得的DNA为平末端，可用于基因克隆、表达及突变分析等分子生物学实验。

产品组成：

成分	规格
KOD DNA聚合酶(5U/μL)	5μl
10×KOD DNA聚合酶缓冲液	1ml
dNTP mix(10mM Each)	0.1ml
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存、有效期一年。

活性定义：1U指75℃条件下，30分钟内使10nmoles的dNTPs掺入酸不溶性沉淀物所需要的酶量。

使用方法：
一、建议PCR条件(以50μl反应体系为例)

成分	体积	终浓度
模板	-	＜0.5μg
正向引物(10μM)	1μl	0.2μM
反向引物(10μM)	1μl	0.2μM
10×KOD DNA聚合酶缓冲液	5μL	1×
dNTPs(10mM each)	1μL	0.2mM
KOD DNA聚合酶	0.25-0.5μL(1.25-2.5U)	-
超纯水	补足到50μL	-

注：实际操作中计算好需补加水的量后，建议先加水，然后按上述顺序添加其它成分，最后添加KOD DNA聚合酶。最好在冰浴上混合PCR各种成分，防止KOD DNA聚合酶降解引物和模板。待各成分充分混匀后，离心数秒，使反应混合物沉到管底。然后将反应管置于PCR仪中进行扩增。

二、关于
PCR条件的优化
1.质粒或者噬菌体模板(模板量5-20ng，循环参数如下表)

循环参数	目标DNA<1kb	目标DNA<2kb	目标DNA3-4kb	目标DNA5-6kb
Step 1	94℃ 2分钟	94℃ 2分钟	94℃ 2分钟	94℃ 2分钟
Step 2	94℃ 20秒	94℃ 20秒	94℃ 20秒	94℃ 30秒
Step 3	Ta 20秒	Ta 20秒	Ta 20秒	Ta 30秒
Step 4	72℃ 20秒	72℃ 30秒	72℃ 40秒	72℃ 60秒
Step 5	72℃ 5分钟	72℃ 5分钟	72℃ 5分钟	72℃ 5分钟
Repeat step 2-4 for 30-35个循环
Ta=Tm－5℃

2.基因组DNA和cDNA模板(基因组DNA模板量为50-100 ng，1-2μl cDNA(起始转录用的RNA为500 ng)，循环参数如下表)

循环参数	目标DNA<2kb
Step 1	94℃ 2分钟
Step 2	94℃ 20-30秒
Step 3	Ta 15-20秒
Step 4	72℃ 20-60秒
Step 5	72℃ 5分钟
Repeat step 2-4 for 30-35个循环
Ta= Tm - 5℃

DNA快速连接试剂盒说明书关键词：BTN70602,Rapid DNA Ligation Kit,DNA快速连接试剂盒

SJ0251 Eriochrome black T  依来铬黑T
ARB10561 人丝*酸蛋白酶抑制因子肽酶抑制因子进化枝3G(Serpina3g)酶标法分析 Human serine/cysteine peptidase inhibitor clade a member 3g,Serpina3g ELISA KIT
曙红Y(水溶) CAMP,Na 17372-87-1
F020204 山羊抗小鼠IgG2b抗体 Goat Anti-Mouse Ig2b
50-99-7 D-无水葡萄糖 D(+)Glucose
ARB12659 大鼠*脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)含量分析 Rat bromodeoxyuridine,brdu ELISA KIT
F030839 BIOTIN标记山羊抗人IgG Fab抗体 Polyclonal Goat Anti-Human IgG Fab*BIOTIN
血液基因组DNA提取系统（0.1-20ml） 
ARB13145 小鼠活化素A(ACV-A)血清中含量检测 Mouse activin a,acv-a ELISA KIT
磷酸缓冲盐溶液(1×PBS,无**,RNase free)   500ml
51-21-8 5-Fluorouracil  5-*尿嘧啶
BFD076 狂犬病毒抗原快速检测卡

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