- ¥6500
- 近岸蛋白(Novoprotein)
- N231-234 A
- 2025年11月16日
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24次
NovoNGSTM DNA Library FlashPrep Kit for Illumina®是针对Illumina高通量测序平台开发的专用试剂盒，可将基因组DNA制备成Illumina高通量测序平台专用的测序文库。该试剂盒采用新型体外转座技术，只需5分钟即可一步实现DNA片段化与接头连接，实验操作快速简单，无需经过传统文库制备时的片段化、末端修复、接头连接等繁琐步骤，并经工艺优化，PCR扩增前无需磁珠纯化，更加省时省力。使用本试剂盒建库时，起始DNA量更灵活，有50ng、20ng、5ng、1ng四种规格可选（目录号分别为：N231，N232，N233，N234）。
特点：
1、快速简单，流畅高效，90分钟完成文库制备；
2、DNA起始量1ng起，可用于微量样本测序，包含四种起始规格，有效避免DNA起始量不足的情况。
质量控制：
试剂盒中提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度上保证文库质量的稳定性和重复性。
适用范围：
适用于将DNA制备成Illumina高通量测序平台专用文库。
产品组成：
| Component | 24 rxns | 96rxns |
| Transposon Mix | 48μl | 192μl |
| 5×Reaction Buffer | 120μl | 480μl |
| 5×Stop Buffer | 135μl | 540μl |
| AmpliMix | 600μl | 2400μl |
保存条件：
-20℃保存，有效期一年。
建库原理及流程：
转座复合体在55℃条件下孵育5min便能一步实现基因组DNA的片段化与加接头两个过程。片段化产物经N5/N7引物（NovoNGSTM Index Kit for Illumina®，提供8种N5引物及12种N7引物的选择，目录号：N237）扩增后，再经过磁珠分选，便可得到测序文库。建库原理及流程示意图如下：
文库结构：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-Index2(i5)-TCGTCGGCAGCGTCAGAT
GTGTATAAGAGACAG-xxxxxxxxx-CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC-Index1(i7)-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’
Adapter：转座复合物中包被的接头，共两种，分别带有N5/N7引物识别序列及转座酶识别序列，文库打断的同时会添加到DNA片段两端
i5和i7：分别代表Index2(i5)和Index1(i7)，均为8 bp；其中Index2(i5)有8种，Index1(i7)有12种
N5和N7：分别携带Index2(i5)和Index1(i7)的引物
-xxxxxxxxx-: 插入序列
流程简示：
注：SB代表5×Stop Buffer
实验耗材及要求：
1、实验耗材准备
新鲜配制的80%乙醇、灭菌超纯水、低吸附EP管和PCR管、磁力架、PCR仪、磁珠。
2、起始DNA的准备与要求
纯化过的DNA溶于灭菌纯水或10mMTris-HCl(pH8.0)，吸光度260/280在1.8~2.0之间。因为转座体用量与DNA起始量密切相关，所以准确测定DNA浓度是实验成功的关键。推荐使用Qubit或荧光染料PicoGreen进行浓度测定，请勿使用以吸光度为基础的任何测定方法。
3、实验流程：
Step1：DNA片段化
- 于室温融解5×Reaction buffer、5×Stop buffer，轻柔混匀后备用；从4℃取出磁珠，室温静置30min备用。
- 在灭菌PCR管中依次添加各反应组分：
-
使用移液器轻轻吹打20次，充分混匀。十分重要！ddH2O To 20μl 5×Reaction buffer 4μl DNA 50ng(或20ng、5ng、1ng) Transposon Mix 2μl
- 将样品置于PCR仪中，反应程序设置如下：
-
105℃ 热盖 55℃ 5min 10℃ 10min - 从PCR仪中取出样品，加入5μl Stop Buffer, 移液器轻柔吹打混匀后再次放回PCR仪，55℃孵育5min后取出。
- Step2：PCR扩增
a.将灭菌PCR管置于冰浴中配制55μl反应体系，依次添加各反应组分：Step1产物 25μl N5引物（8选1） 2.5μl N7引物（12选1） 2.5μl AmpliMix 25μl
b.移液器轻轻吹打，充分混匀。
c.PCR扩增程序如下：
72℃* 3min
98℃ 30sec
98℃ 30sec
60℃ 30sec 4-13cycles
72℃ 120sec
72℃ 2min
10℃ Hold
*: 72℃孵育3min为链置换反应，此步骤不可省略。
PCR循环数多则文库产量高，但对应Duplication会增多，请根据测序需要进行选择。每种试剂盒，不同循环数对应的文库产出请参照附表一。
Step3：扩增产物长度分选
如对文库长度分布无特殊要求，可直接使用1.0×磁珠纯化文库扩增产物，不需进行片段分选。
以下为采用磁珠两步分选法对扩增产物进行长度分选的步骤，请优选NovoNGSTM DNA Screen Beads(货号：N240)，如使用其他品牌磁珠，使用方法请以该品牌说明书推荐的体系为准。文库平均总长度 ~350bp ~450bp ~550bp ~680bp 文库平均插入长度 ~220 bp ~320 bp ~420 bp ~550bp 第一轮磁珠用量V1 0.7× 0.6× 0.55× 0.45× 第二轮磁珠用量V2 0.2× 0.15× 0.15× 0.15×
举例：“0.7×”代表磁珠与PCR产物的体积比，若PCR产物体积为50μl，则第一轮磁珠用量0.7×50μl =35μl，第二轮磁珠用量为：0.2×50μl=10μl。
注意：由于PCR过程中水分蒸发导致PCR产物体积小于50μl，请务必用ddH2O补齐至50μl，否则会导致分选长度和预期不一致。
片段筛选： - 涡旋振荡混匀磁珠后，吸取V1体积磁珠加入50μl PCR产物中，使用移液枪轻轻吹打充分混匀，室温孵育5 min；
- 将反应管短暂离心后置于磁力架，使磁珠与液体分离（约5 min，溶液澄清后），小心转移上清至干净的EP管中，丢弃磁珠；
- 涡旋振荡混匀磁珠后，吸取V2体积磁珠至上清中，使用移液枪轻轻吹打充分混匀，室温孵育5 min；
- 将反应管短暂离心后置于磁力架，使磁珠与液体分离（约5 min，溶液澄清后），小心移除上清；
- 加入200μl新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec后，小心移除上清，此过程仍保持反应管置于磁力架中；
- 重复步骤（5）一次；
- 保持反应管置于磁力架中，打开管盖，室温晾干约7min，使乙醇充分挥发，切记磁珠不要干燥过度；
- 将反应管从磁力架上取下，加入22μl无菌超纯水洗脱，吹打混匀或涡旋混匀后室温孵育3min；
- 将反应管短暂离心后置于磁力架，使磁珠与液体完全分离（约2 min，溶液澄清后），小心吸取20μl上清至新的无菌PCR管内中，-20℃保存。
- 附表一：
N231(50ng DNA 起始) 扩增循环数：
N232(20ng DNA起始) 扩增循环数：
N233(5ng DNA 起始) 扩增循环数：
N234(1ng DNA 起始) 扩增循环数：4
6
8
115
7
9
126
8
10
137
9
11
14文库产出（不进行片段分选，ng）： 400 600 1000 1500
文库长短分布检测及长度分选效果: 
- Agilent 2100 Bioanalyzer文库质量分析
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Multiplex Illumina Sequencing Using DNA Barcoding
cell. The quality and quantity of purified library DNA can be evaluated by qPCR and Bioanalyzer analyses, respectively. DNA libraries are then ready for mixing and Illumina sequencing. When mixing libraries with severe primer dimer contamination
Digital Gene Expression by Tag Sequencing on the Illumina Genome Analyzer
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