一管式点突变试剂盒批发

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。

百奥莱博专业生产销*(代"售")一管式点突变试剂盒批发，我公司供应的分子生物学试剂品类齐全，且具有优势价格，欢迎新老客户垂询订购。

名称：一管式点突变试剂盒批发
编号：BTN100212
英文名：One-Tube Mutagenesis Kit
产地：国产|进口
规格：10次
品牌：百奥莱博
基因的定点突变是重要的分子生物学技术，广泛用于载体构建、基因改造、蛋白质功能研究等领域。但传统的方法需要使用单链DNA 模板，而得到单链DNA 模板又需要先将基因克隆到类似M13 这种载体中，操作过程冗长。为了克服这些缺点，本公司将突变位点设计到一对互补的引物中，用高保真扩增质粒模板，然后用Dpn I 去除原始的甲基化模板，新合成的DNA 通过互补形成带切口的双链质粒，直接用于转化感受态细菌。

产品特点：
1. 直接使用质粒DNA作为模板，免去了制备单链DNA的步骤。
2.基于高保真PCR，对模板DNA 序列没特殊要求，可以用于突变任何序列。同时对模板的需求量很少。
3.一管式，全部在一个优化的缓冲体系中完成，非常简单。
4. 使用Dpn I 去除未突变模板，突变效率高达90%。
5.可用于制备点突变，缺失突变和插入突变。
6. 本产品A型适用于8 kb以下，B型适用于8-15 kb。

试剂盒组成：

 

成分	10T(A型)	10T(B型)
高保真酶A型	10μl	无
高保真酶B型	无	10μl
5×高保真酶Buffer A型	100μl	无
5×高保真酶Buffer B型	无	100μl
dNTP(2.5mM each)	50μl	50μl
Dpn I酶	10μl	10μl
超纯水	1ml	1ml

储存条件：低温运输、-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、引物设计及注意事项
用于特定基因突变的引物必须用户单独设计，请参考如下一些基本原则进行设计。
1. 共需设计两条完全互补的一对引物，它们覆盖要扩增的突变区位点，突变位点最好放在引物的中心。可以先集中设计一条，然后就可得互补的另一条引物。
2.引物的长度通常为25-45个碱基。引物中突变位点任何一侧都必需满足Tm大于45的条件，Tm 计算方式为Tm=4×(GC 碱基数)＋2×(AT 碱基数)。例如引物agtcaggccaattcgAAGcagtcgaattgccaag 就达到此标准，它的突变位点AAG 所放位置使左侧Tm＝46；右侧Tm＝48，均大于45。
3. 尽量把引物的GC含量控制在40％-60％，结尾的1-3个碱基最好是G或C。
4. 尽量使引物不要产生非常稳定的二级结构和引物二聚体。
5. 最好使用经过PAGE 纯化的引物或更高纯度的引物。

二、待突变模板质粒的选择
1. 必需使用从dam＋的大肠杆菌(这类菌中质粒可以被甲基化)中抽提得到的质粒用于基因定点突变，否则Dpn I 不能把没有酶切的质粒DNA 切除，产生大量的假阳性。常用的大部分大肠杆菌都是dam＋的，包括DH5α、JM109等。不能使用JM110和SCS110以及其它dcm-菌种。
2. 待突变质粒和目的基因的GC含量应该在40-55％，没有任何GC含量超过70%、长度在50bp以上的区域。如果质粒GC含量过高，请先把目的基因克隆到其它合适的载体上，再进行基因定点突变反应。如果目的基因GC含量过高，而突变位点不在高GC含量区域，可以先把该基因的不含高GC含量的一个区域克隆出来，进行定点突变，然后再把突变后的片断克隆回原基因中。如果突变位点在高GC 区，则可以使用高GC 专用PCR反应试剂。

三、基因定点突变反应
1.在一个塑料离心管中加入下列成分：

待突变模板质粒	0.1-0.5μg
5×高保真酶Buffer	10μl
引物一(10-20 uM)	1μl
引物二(10-20 uM)	1μl
dNTP Mix(2.5mM each)	4μl
补水到	49μl

2. 加入1μl高保真DNA聚合酶，混匀，如果PCR仪没有热盖则需要加少量石蜡油。放入PCR仪器中按下面参数进行PCR：

步骤	温度	时间	循环数
变性	95℃	1min	1次
PCR	95℃	40s	18次
	60℃	1min
	68℃	1min/Kb
延伸	72℃	10min	1次
保存	4℃	长时间保持

四、Dpn I消化
PCR反应后，直接在PCR反应体系中加入1μL Dpn I内切酶(该酶在甘油保存液中会下沉到管底，故用前需要充分混匀)。DpnI可以酶切双链都被甲基化的模板质粒，也能降解一条链被甲基化的双链质粒。混匀后37℃孵育2小时后样品可以直接用于转化，或者-20℃保存备用。

五、转化、挑克隆鉴定：
每100 微升感受态细菌(转化效率必须在107/μg以上)中可以加入5-10微升经过Dpn I 消化后的突变产物，按照所使用的感受态细菌的操作方法进行操作。如果PCR 使用了石蜡油，在转化时千万别把它带入转化反应，否则会严重影响转化效率。
在涂板前通过离心浓缩的办法，把所有被转化后的细菌全部涂布到含有适当抗生素的平板上培养过夜。通常会得到50个以下的克隆，可按常规方法制备质粒并测序。

六、常见问题：
1.转化后没有克隆或克隆数极少：
(1)感受态细菌效率不够高，请检测一下感受态细胞的效率，确保转化效率在107/μg。
(2)把Dpn I 消化后的产物用常规的乙醇沉淀浓缩，这样就可以把所有的产物全部用于转化。
(3)优化基因定点突变中的PCR参数。可以把最初的95℃变性时间延长为2分钟，循环中95℃变性的时间延长至1分钟，把循环中的68℃的延伸时间改为1.5分钟/kb 至2分钟/kb，退火可以改为60-55℃或65-55℃等的touch down，退火时间也可以适当延长。
(4)引物设计有问题。通过突变反应中的PCR 没有很好地扩增出预期的突变质粒。
2.有克隆，但没有或很难检测到预期的突变克隆：
使用的待突变的模板质粒量过多，导致Dpn I 消化时不完全，可减少质粒用量。
3. 有突变克隆，但突变位点不是预期的位点：
(1)引物设计不佳，退火温度过低，导致引物退火到错误的地方。
(2)引物质量较差，没有经过PAGE 纯化。这样引物中通常会含有比设计的引物要短的特异性较差的引物，容易导致非预期的突变。

想要了解更多关于一管式点突变试剂盒批发的价格、品牌、厂家、说明书、促销信息，请和我们联*(代"系")。此外我公司还销*(代"售")下面的产品：
SJ0685 100bp plus
脱氧胆酸*溶液  10%|5%|1% 100ml
PY04-020  新生霉素  2mg/支×10支  每支添加于100ml改良EC肉汤中制成mEC肉汤，用于肠出血性大肠杆菌O157;H7选择性增菌
F050305 猪IgG抗体 Pig IgG
4-硝基*(代"*")甲醛 H-Pro-OMe?HCl 555-16-8
L-组*酸盐*(代"酸")盐一水物 L-Asparagine 5934-29-2
ARB11991 大鼠NA-K-ATP酶免费代测 
F020208 山羊抗兔IgG抗体 Goat Anti-Rabbit IgG
BL1238 SOC液体培养基(干粉)
BL0898 FITC标记羊抗人纤维蛋白原抗体
植物核蛋白/细胞器蛋白提取试剂盒   50T|100T
BL0908 FITC标记兔抗狗IgG抗体
米氏酮 TCEP 90-94-8
谷胱甘肽还原酶 Sepharose 6FF 9001-48-3
Acr-Bis(37.5%:1%)   500ml
BTN80104 一站式柱式miRNAOUT One-Stop Column miRNAOUT
酵母聚糖A L-Alanine methyl ester hydrochloride 58856-93-2
HC0177 PE手套
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·琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(柱式吸附)
编号：BTN60202
英文名称：Agarose gel DNA column Recovery Kit
规格：50次
本试剂盒用于从琼脂糖凝胶中或DNA反应体系中(如PCR反应)回收DNA片段。试剂盒采用可以高效、专一结合DNA的硅胶膜和独特的溶胶体系，或DNA反应体系中回收的DNA片段，回收效率可达50-90%(跟片段大小相关)。

产品特点：
1.高效，回收效率最高可达90%(跟片段大小和胶浓度等因素有关)。
2.快速，整个过程只需要十余分钟。
3. 回收DNA的范围为50bp－40Kb(但效率各不相同)。
4. 纯度高，本试剂盒回收的DNA可直接用于酶切、连接、PCR登等多种分子生物学实验。
5. 用途广，本试剂盒能回收单链、双链及环状DNA。
6. 储存方便，试剂盒可以在室温放置数月，不影响其质量。

试剂盒组成：

成分	规格
通用溶胶液	25ml
通用洗柱液	50ml
离心吸附柱	50套
DNA洗脱液2.0	10ml
说明书	1份

储存条件：常温运输及保存，有效期为一年。

使用方法：
1. 对胶回收：切取含DNA片段的琼脂糖凝胶(100mg左右，尽可能多地把多余的胶切除，否则会影响回收效率)，放入一干净的1.5mL塑料离心管(自备)中，用移液枪头捣碎，按重量比为1：3到1：5的比例加入通用溶胶液(100mg琼脂糖凝胶需要加入300μL-500μL通用溶胶液)。
 PCR回收：直接在PCR反应管中加3-5倍体积的通用溶胶液，混匀，然后跳过第2步、直接从第3步做起。如果PCR反应中使用了石蜡，需要预先去除。
2. 50℃保温使胶完全溶化(一般需要5分钟)，其间可以振荡数次以促进琼脂糖凝胶的溶化。如果片段长度在300bp以下，建议不要加热，以免DNA变性，影响回收率。
3. 将离心管中的溶液转移到离心吸附柱中，套上液体收集管，静置3分钟。
 注意：静置有助于DNA与离心吸附柱的硅胶膜结合。若一次加不完，可分两次加入并离心。
4. 12000～15000g离心1分钟，倒掉收集管中的液体。
5. 加入0.7-0.8mL通用洗柱液于离心柱中，室温静置2分钟。
6. 12000～15000g离心1分钟，倒弃收集管中的废液。
7. 12000～15000g离心半分钟以去除离心柱中的残留液体。
8. 将离心柱置于一新的干净的塑料离心管(自备)中，加入30-100μl DNA洗脱液2.0于离心吸附柱硅胶膜的中央，静置3分钟。
9. 12000～15000g离心1分钟。
10.离心管底部所得溶液即为纯化的DNA溶液，可立即用于后续实验或者放-20℃长期保存。

注意事项：
1.电泳回收DNA时，电泳缓冲液可以为TAE、TBE或者DNA/RNA两用快速电泳液SuperBuffer-2。回收效果为SuperBuffer-2最好，TAE次之，TBE最差。详细见SuperBuffer-2产品介绍。
2. 通用洗柱液含有容易挥发物质，使用后一定要拧紧瓶盖，密闭保存。
3. 琼脂糖凝胶体积的大小与回收率成反比关系，即体积越大，越不利于回收，一次胶回收以使用100mg琼脂糖凝胶为宜。
4. 如果在五分钟内凝胶溶化不完全，可以适当的延长水浴时间以使胶充分溶化，否则DNA包裹在琼脂糖凝胶中，影响DNA的回收效率。
5.胶溶化后的液体转移到离心柱后，可以延长静置时间使DNA与膜充分结合，提高回收效率。
6. 洗脱DNA前的空甩很重要，其目的是去除膜上残留酒精，否则残留酒精会影响后续DNA反应。
7. 增大DNA洗脱液2.0使用量有利于回收，但要注意实际上样量与最终回收体积的关系，以便于计算回收率。DNA洗脱液2.0可以用TE或水替代，但回收率稍有降低。


一管式点突变试剂盒批发关键词：一管式点突变试剂盒,BTN100212,One-Tube Mutagenesis Kit


·miRNA分离纯化试剂盒(凝胶法)
编号：BTN130972
英文名称：miRNA isolation Kit(Gel method)
规格：50次

·放线菌*(代"素")D
编号：BTN120680
英文名称：Actinomycin D Solution
规格：1mL
本品为浓度为1mg/mL 放线菌*(代"素")D的DMSO溶液。放线菌*(代"素")D(更生霉素；Cosmegen、Meractinomycin),分子式为C62H86N12O16，分子量：1255.41。可作为代谢抑制剂，细胞质膜研究。它能抑制RNA的合成，作用于mRNA，干扰细胞的转录过程，阻止蛋白质的合成。吞食有极高毒性。

抗性机制：放线菌*(代"素")D分子中含有一个*氧环结构，通过它连接两个等位的环状肽链。此肽链可与DNA分子的脱氧鸟嘌呤发挥特异性相互作用，使dactinomycin D嵌入DNA双螺旋的小沟中，与DNA形成复合体，阻碍RNA多聚酶的功能，抑制RNA的合成，特别是mRNA的合成。

储存条件：低温运输，-20℃避光保存，有效期6个月。

我公司正在优惠促销基因结构和功能等系列产品，期待您的咨询选购一管式点突变试剂盒批发。