WE0234型cfDNA文库定量试剂盒(Illumina平台

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。

北京百奥莱博专注于生命科学和生物技术领域，致力于为客户提供包括WE0234型cfDNA文库定量试剂盒(Illumina平台)厂家在内的一系列分子生物学试剂产品，并提供一系列相关的技术服务。

名称：WE0234型cfDNA文库定量试剂盒(Illumina平台)厂家
规格：1ml|5ml
品牌：百奥莱博
编号：WE0234
英文名：NGS Library Quantification Kit for Illumina
  本产品是采用染料法(SYBR Green I)对NGS建库后的产物进行实时荧光定量PCR(qPCR)。试剂盒提供了qPCR过程所需的反应混合液，DNA引物混合物、标准品以及样品稀释液，试剂体系完整，操作简单方便。反应混合物中所含的荧光染料SYBR Green I 可以与所有的双链DNA结合。本试剂盒使用的是一种经化学修饰的全新高效热启动聚合酶，酶的激活需在95℃下孵育10 min。该产品特异性强、扩增效率高，能够对构建的文库浓度进行快速准确的定量。
  ROX染料用于校正定量PCR仪孔与孔之间产生的荧光信号误差，一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR扩增仪。不同仪器的激发光学系统有所不同，因此ROX染料的浓度必须与相应的荧光定量PCR仪相匹配。
  不需要ROX校正的仪器： Roche LightCycler 480，Roche LightCyler 96，Bio-radiCyler iQ，iQ5，CFX96等。
  需要Low ROX校正的仪器： ABI Prism7500/7500 Fast，QuantStudio® 3 System，QuantStudio® 5 System， QuantStudio® 6 Flex System，QuantStudio® 7 Flex System，ViiA 7 system， Stratagene Mx3000/Mx3005P，Corbett Rotor Gene 3000等。
  需要High ROX校正的仪器： ABI Prism7000/7300/7700/7900，Eppendorf，ABI Step One/Step One Plus等。

关于WE0234型cfDNA文库定量试剂盒(Illumina平台)厂家的更详细说明，请致电我公司咨询，我们将以最饱满的热情为您提供解答，此外，我公司专业供应下列产品：

·2×Babuddy MasterMix(含染料)
编号：WE0110
英文名称：2×Babuddy MasterMix(With Dye)
规格：1ml|5ml
  本品是由Babuddy Super Fidelity DNA Polymerase、PCRBuffer、Mg2+、dNTPs以及PCR稳定剂和增强剂组成的预混体系，浓度为2×。Babuddy Super Fidelity DNA Polymerase是一种快速、高扩增效率的高保真DNA聚合酶，具有5"-3"DNA聚合酶活性和3"-5"外切核酸酶活性。经过改造的聚合酶其活性区域融合有一段聚合增强结构域，独特的结构极大提升了保真性和延伸速度。Babuddy Super Fidelity DNA Polymerase的保真性是普通Taq DNA Polymerase的50倍，是普通Pfu的6倍。其延伸速率为15-30s/kb，成功克服了普通Pfu酶扩增效率低、扩增速度慢的缺陷，大大缩短了反应时间。
  本品特别适合于在基因克隆实验中扩增长片段DNA，尤其在扩增>10 kb的DNA片段时，优势更加明显，所扩增的片段最长可达20 kb。预配好的PCR混合液使操作更加简单快捷，可最大限度地减少人为误差和污染。
  使用本产品扩增得到的PCR产物的3"端不带有“A”碱基，可直接克隆于平末端载体中。如需进行T/A克隆，需在PCR产物末端添加“A”后进行克隆。本产品具有延伸速度快、扩增效率高、保真性强的特点。适用于基因克隆、基因定点突变、SNP等实验。本产品已加入染料(蓝色)，反应结束后可直接进行电泳检测，无需再使用上样缓冲液。

产品特点：
1、高保真性：保真性是普通Taq DNA Polymerase的50倍，普通Pfu的6倍。
2、扩增速度快：其延伸速率为15-30sec/kb，成功克服了普通Pfu酶扩增效率低、扩增速度慢的缺陷。
3、特别适合于扩增长片段：扩增的片段长度可长达20kb。

产品组成：

 

组份	1ml	5ml
2×Babuddy MasterMix(With Dye)	1ml	5×1ml
ddH2O	1ml	5×1ml

注意：2×Babuddy MasterMix含有Babuddy DNA Polymerase,2×PCR Buffer, 3 mM MgCl2和400μM dNTP mix。

使用方法：
以下举例为常规PCR反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小不同进行相应的改进和优化。

1、PCR反应体系

试剂	20μl反应体系	50μl反应体系	终浓度
2×Babuddy MasterMix	10μl	25μl	1×
Forward Primer，10μM	1μl	2.5μl	0.5μM
Reverse Primer，10μM	1μl	2.5μl	0.5μM
Template DNA	适量	适量	<250ng
ddH2O	up to 20μl	up to 50μl

a．模板：在50μl PCR反应体系中，DNA模板的建议用量为低复杂度模板(如质粒DNA，λDNA等)1 pg- 10ng，高复杂模板(如基因组DNA)50-250ng。
b．引物：引物浓度请以终浓度0.2-1.0μM作为设定范围的参考，推荐终浓度为0.5μM。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。

2、PCR反应条件
常规三步法PCR反应：

步骤	温度	时间	循环数
预变性	98℃	30 s-3 min
变性	98℃	5-10 s	25-35 个循环
退火	45-72℃	10-30 s
延伸	72℃	2-4 kb/min
终延伸	72℃	5-10 min

a．变性：简单模板的预变性温度为98℃，预变性时间为30 s。对于比较复杂的模板，预变性时间可延长至3分钟。
b．退火：使用本产品时，退火温度设定的基本原则是，当引物长度小于或等于20 nt时，退火温度为引物最低的Tm；当引物长度大于20 nt时，退火温度应在最低Tm的基础上以Tm+3℃退火10-30 s。当无法得到理想的扩增效率时，应以最低的Tm值逐步提升至模板延伸温度。对于Tm高的引物可以使用两步法PCR。
c．延伸：本产品中所包含的Babuddy DNA Polymerase的扩增效率为2-4 kb/min，复杂性低的模板可用4 kb/min，复杂性高的基因组DNA模板，延伸时间则应为2 kb/min，对于一些cDNA模板，延伸时间可增加到1.5 kb/min。
d．循环次数：可根据扩增产物的下游应用设定循环数。如果循环次数太少，扩增量不足；如果循环次数太多，错配机率会增加，非特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。

当引物的退火温度较高时，建议使用两步法进行PCR扩增：

步骤	温度	时间	循环数
预变性	98℃	30 s-3 min
变性	98℃	5-10 s	25-35 个循环
延伸	72℃	2-4 kb/min
终延伸	72℃	5-10 min

储存条件：-20℃，避免反复冻融。


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·红细胞裂解液
编号：WE0218
英文名称：RBC Lysis Buffer
规格：100ml
  本产品是利用细胞内外盐离子浓度差可导致细胞膜胀破的原理来裂解红细胞，主要用于实验中红细胞的去除，比如：淋巴细胞的分离纯化，经酶消化分散的组织细胞的分离纯化，以及组织细胞蛋白与核酸提取等实验中红细胞的去除。

使用方法：
1、向1倍体积的新鲜全血中加入3倍体积的红细胞裂解液(如1ml新鲜全血加入3ml红细胞裂解液)轻轻涡旋或颠倒混匀。
注意：如果对新鲜组织细胞进行处理，需经胰酶等消化成单个细胞悬液，离心收集细胞后再进行后续操作。
2、冰上孵育15分钟，其间轻轻涡旋混匀两次。
注意：红细胞裂解后，溶液应该是清亮透明的。
3、4℃，450×g离心10分钟收集白细胞，小心吸弃上清液。
4、向以上沉淀中加入两倍体积的红细胞裂解液，轻轻涡旋充分重悬白细胞(如起始血液为1ml，则加入2ml的红细胞裂解液)。
5、4℃，450×g离心10分钟收集白细胞，小心并彻底吸去上清液。
6、重悬细胞，用于后续实验。
注意：如提取RNA，最好从此步开始使用无RNase的溶液进行。

储存条件：室温(15～30℃)


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·AP标记山羊抗兔IgG(H+L)
编号：WE0391
英文名称：Goat Anti-Rabbit IgG, AP Conjugated
规格：100μl
本产品为碱性磷酸酶标记的经亲和纯化的山羊抗体，特异识别兔IgG，对其他种属IgG无明显交叉反应，检测灵敏度高，本底低，可用于Western Blot和ELISA检测。AP即碱性磷酸酶，可以催化BCIP/NBT等底物显色或催化适当的化学发光试剂产生化学发光。

免疫原：兔IgG
缓冲液：0.01M Tris-HCl，0.25M NaCl，50%甘油，pH8.0
稳定剂：15 mg/ml BSA(不含IgG和蛋白酶)
防腐剂：0.05%叠氮*
应用范围：WB(1：2000-10000)、ELISA(1：2000-20000)

·超纯RNA提取试剂盒
编号：WE0192
英文名称：SuperPure RNA Extraction Kit
规格：50次|200次
  本试剂盒是基于TRIzon改进后的柱式总RNA提取试剂盒，裂解液充分裂解并匀质化样本，采用独特的硅基质膜吸附技术，通过离心吸附柱在高盐状态下高效专一的结合溶液中的RNA，同时最大限度的有效除去蛋白质、无机盐离子及有机杂质等；可从动物组织、植物材料、各种微生物及培养细胞等样品中快速提取总RNA，每次可处理 30-50 mg组织或5×106细胞，可同时处理多个不同样品。本试剂盒提取得到的RNA可直接应用于RT-PCR、Northern Blot、Dot Blot、体外翻译等实验。

试剂盒组成：
 

组份	50次
TRIzon Reagent	60ml
Buffer RW1	40ml
Buffer RW2(浓缩液)	11ml
RNase-Free Water	10ml
吸附柱RM及收集管	50套
RNase-Free离心管(1.5ml)	50个

保存条件：TRIzon Reagent 2～8℃避光保存，其他组分室温(15～30℃)。

自备试剂：*仿(新开封或提取RNA专用)、70%乙醇(无RNase水配制)、无水乙醇。

产品特点：
1、纯度高：最大限度除去蛋白质等杂质，提取的RNA可直接用于下游各种实验。
2、提取量大：独特的裂解液配方，充分裂解细胞或组织，RNA提取量多至100μg。
3、快速：步骤少，操作简单，节省时间。
4、兼容性强：适用于多种动植物组织和细胞RNA的提取。

实验前准备及重要注意事项/strong>：
1、预防RNase污染，应注意以下几方面：
1)使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。
2)玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时，塑料器皿可在0.5 M的NaOH中浸泡10分钟，用水彻底冲洗后高压灭菌。
3)配制溶液应使用无RNase的水。
4)操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。
2、样品应避免反复冻融，否则影响RNA提取得率和质量。
3、使用前若发现TRIzon Reagent有沉淀，可置于56℃水浴几分钟，即可溶解。
4、第一次使用前应按照试剂瓶标签说明在Buffer RW2中加入无水乙醇。
5、所有离心步骤若无特殊说明均在室温下进行，且所有操作步骤动作要迅速。
6、若下游实验对DNA非常敏感，建议用不含RNase的DNase I(货号：WE0213S)对RNA进行处理。

操作步骤：
1、样品处理
①植物组织：取新鲜植物组织在液氮中充分研磨或将植物组织剪碎后直接在TRIzon Reagent中迅速研磨，每30-50 mg组织加入1ml TRIzon Reagent，混匀。
注意：样品体积一般不要超过TRIzon Reagent体积的10%。
②动物组织：取新鲜或-70℃冻存的动物组织尽量剪碎，每30-50 mg组织加入1ml TRIzon Reagent，匀浆仪进行匀浆处理。或在液氮中研磨后加入TRIzon Reagent 1ml混匀。
注意：样品体积一般不要超过TRIzon Reagent体积的10%。
③单层培养细胞：吸去培养液，可直接在培养板中加入适量TRIzon Reagent(每10cm2 面积需要1ml TRIzon Reagent)，用取样器反复吹打使细胞裂解。也可用胰蛋白酶处理后，将细胞溶液转移至RNase-Free的离心管中，300×g离心5 min，收集细胞沉淀，仔细吸除所有上清，加入TRIzon Reagent 1ml混匀。
注意：
1)收集细胞数量不要超过1×107。
2)TRIzon Reagent加量根据培养板面积决定，不是由细胞数决定。如果TRIzon Reagent加量不足，可能导致提取的RNA中有DNA污染。
3)收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净，否则会导致裂解不完全，造成RNA的产量降低。
④细胞悬液：离心收集细胞。每5×106-1×107动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加入1ml TRIzon Reagent。
注意：
1)加入TRIzon Reagent前不要洗涤细胞，以免RNA降解。
2)一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪或液氮研磨处理。
⑤血液处理：直接取新鲜的血液，加入3倍体积的TRIzon Reagent(推荐0.25ml全血加入0.75ml TRIzon Reagent)，充分振荡混匀。
⑥可选步骤：对于蛋白、脂肪、多糖或胞外物质含量高的样品，如肌肉组织、脂肪组织或植物的块茎，可以在匀浆处理后4℃，12000rpm(~～13400×g)离心10分钟以除去不溶物质，此时沉淀中含胞外物质、多糖和高分子量的DNA，而RNA存在于上清中。

2、样品中加入TRIzon Reagent后反复吹打几次，使样本充分裂解。室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离。
3、以每1ml TRIzon Reagent加入200μl*仿的比例加入*仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置2分钟。
4、4℃ 12000rpm(~～13400×g)离心10分钟，此时样品分为三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主要在上层水相中，将上层水相移到一个新的RNase-Free离心管(自备)中。
5、在得到的水相溶液中加入等体积的70%乙醇(无RNase水配制)，颠倒混匀。
6、将上步所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中。若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
7、向吸附柱中加入700μl Buffer RW1，12000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
8、向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
9、重复步骤8。
10、12000rpm离心2 分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，彻底晾干。
注意：这一步目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续酶促反应(酶切、PCR等)。
11、将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位加入30-50μl RNase-Free Water，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。
注意：
1)RNase-Free Wate体积不应小于30μl，体积过小影响回收率。
2)如果要提高RNA的产量，可用30-50μl新的RNase-Free Water重复步骤11。
3)如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤11。

储存条件：室温(15～30℃)。

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