北京现货一步法逆转录实时荧光定量PCR试剂盒(低含量ROX校

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。

北京百奥莱博主要从事生物试剂的生产和销*(代"售")，产品线涵盖北京现货一步法逆转录实时荧光定量PCR试剂盒(低含量ROX校正染料)优惠价在内的分子生物学试剂产品，还包括PCR及荧光定量PCR、核酸提取试剂盒类、样本核酸保护试剂、核酸提取、克隆与转化、蛋白纯化、蛋白检测、免疫组化、细胞凋亡与抗体等。

名称：北京现货一步法逆转录实时荧光定量PCR试剂盒(低含量ROX校正染料)优惠价
编号：WE0149
英文名：BaldStar TaqMan One Step RT-qPCR Kit(Low ROX)
规格：100次
品牌：百奥莱博
  本试剂盒是采用探针法(TaqMan，Molecular Beacon等)进行一步法Real-Time RT-qPCR的专用试剂盒。使用本产品进行Real Time RT-qPCR反应时，逆转录和定量PCR在同一反应体系中进行，反应过程中无需添加试剂，无需打开管盖，避免了污染的同时提高了实验效率。本产品的检测灵敏度高，荧光信号强，信噪比高，非常适合于RNA病毒等微量RNA的检测。其所包含的特殊缓冲系统能使逆转录酶与DNA聚合酶同时发挥最大功效，提高反应效率。使用本产品可以得到更宽广的线性范围，对目的基因定量更准确，重复性好，可信度高。

  ROX染料用于校正定量PCR仪孔与孔之间产生的荧光信号误差，一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR 扩增仪。不同仪器的激发光学系统有所不同，因此ROX染料的浓度必须与相应的荧光定量PCR仪相匹配。
不需要ROX校正的仪器:(WE0148)
Roche LightCycler 480，Roche LightCyler 96，Bio-rad iCyler iQ，iQ5，CFX96等。
需要Low ROX校正的仪器：(WE0149)
ABI Prism7500/7500 Fast，QuantStudio® 3 System，QuantStudio® 5 System，QuantStudio® 6 Flex System，QuantStudio® 7 Flex System，ViiA 7 system，Stratagene Mx3000/Mx3005P，Corbett Rotor Gene 3000等。
需要High ROX校正的仪器：(WE0150)
ABI Prism7000/7300/7700/7900，Eppendorf，ABI Step One/Step One Plus等。

试剂盒组成：

 

组份	WE0148-100次	WE0149-100次	WE0150-100次
2×BaldStar TaqMan One Step Buffer	1.4ml	1.4ml	1.4ml
BaldStar TaqMan One Step EnzymeMix	100μl	100μl	100μl
50×Low ROX	-	50μl	-
50×High ROX	-	-	50μl
RNase-Free Water	1.5ml	1.5ml	1.5ml

注意事项：
1、本试剂盒中试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。
2、本产品以RNA为模板进行一步法RT-PCR实验，在操作过程中应避免RNase污染，建议在专门的区域进行RNA操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并经常更换手套，实验相关耗材应用0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理12小时,并高压灭菌30分钟后使用。
3、本试剂盒中的各试剂应尽量避免反复冻融，反复冻融可能使产品性能下降。
4、本试剂盒必须使用特异性引物，引物的选择可根据具体实验来选择，引物设计的好坏直接影响到RT-qPCR反应的结果，设计引物时需考虑GC含量，引物长度，引物位置，PCR产物的二级结构等因素，建议采用专业的引物设计软件进行设计。
5、本试剂盒推荐使用特异性探针，建议采用专业的设计软件进行设计。


使用方法：
以下举例为常规的反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小的不同进行相应的改进和优化。(反应液的配置请在冰上进行)

1、将RNA模板、引物、2×BaldStar TaqMan One Step Buffer、BaldStar TaqMan One Step EnzymeMix和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
2、PCR反应体系：
 

试剂	25μl反应体系	终浓度
2×BaldStar TaqMan One Step Buffer	12.5μl	1×
Forward Primer，10μM	0.5μl	0.2μM
Reverse Primer，10μM	0.5μl	0.2μM
Probe，10μM	0.5μl	0.2μM
BaldStar TaqMan One Step EnzymeMix	1.0μl
RNA Template	Xμl	10 pg～100ng
50×Low ROX or High ROX(可选)	0.5μl	1×
RNase-Free Water	up to 25μl

注意：
1)通常引物浓度以0.2μM可以得到较好结果，可以在0.1-1.0μM作为设定范围的参考。
2)使用的探针浓度，与使用的荧光定量PCR仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行浓度的调节。
3)通常RNA模板的量以10 pg – 100ng为参照，因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。
4)不同仪器的激发光学系统有所不同，根据使用荧光定量的仪器选择加入50×Low ROX or 50×High ROX。

3、混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。
4、RT-PCR反应条件：
 

步骤	温度	时间	循环数
逆转录	45℃	10 min
PCR预变性	95℃	10 min
变性	95℃	15 s	30-40个循环
退火/延伸	60℃	45 s

注意：
1)1)本产品所采用的热启动酶须在预变性95℃、5-10 min条件下实现酶的活化。
2)建议采用两步法PCR反应程序，若因使用Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法PCR扩增，退火温度请以 56℃-64℃的范围作为设定参考。

储存条件：-20℃，避免反复冻融

北京现货一步法逆转录实时荧光定量PCR试剂盒(低含量ROX校正染料)优惠价极具性价比，此外，我公司正火爆促销以下产品：

·NC膜(0.22μM)
编号：WE0299
英文名称：Nitrocellulose Membrane(0.22μM)
规格：1 sheet

·SDS-PAGE凝胶制备试剂盒
编号：WE0293
英文名称：SDS-PAGE Gel Kit
规格：40-60 gels|200-300 gels
  本试剂盒包括SDS-PAGE凝胶制备所需全*(代"套")试剂，只需自备蒸馏水，即可制备高质量各种浓度的变性PAGE凝胶，方便、快捷。本试剂盒在分离胶缓冲液和浓缩胶缓冲液中已加入10%SDS,使用时不用另外加入。

试剂盒组成：

组份	40-60 gels	200-300 gels
30%Acr-Bis(29:1)	100ml	2×250ml
SDS-PAGE Separating Gel Buffer(4×)	100ml	500ml
SDS-PAGE Stacking Gel Buffer(4×)	50ml	250ml
APS	0.5 g	2.5 g
TEMED	1ml	5 m l

本产品所提供的APS(过硫*(代"酸")铵)为固体粉末，使用前加入纯水溶解即配制成10%APS溶液(0.5 g APS加5ml纯水、2.5 g APS加25ml纯水)，将溶液分装后置于-20℃保存，通常半年内有效。溶液在使用中可放置4℃保存两周。

注意事项：
1、10%APS配制后分装-20度保存。APS溶液不稳定，应尽量减少室温存放时间，每次取用后立即放回冰箱，以防失效；若发现凝胶聚合时间延长，应考虑更换使用-20度保存的10%APS。
2、PAGE凝胶的凝聚速度与温度以及APS、TEMED的用量密切相关；在其它条件不变的情况下，可通过改变APS及TEMED的用量，控制PAGE凝胶的聚合速度，凝胶聚合过快不利于操作；附表中的APS及TEMED量可供参考，应根据实际操作情况做适当的调整。
3、在凝胶配制过程中，尤其是液体混匀步骤，应尽量避免气泡的产生。
4、在分离胶上层加纯水时要小心操作，加水时速度不能太快。
5、丙*(代"烯")酰胺具有神经毒性，操作时请穿着实验服并佩戴一次性手套。
6、本产品仅用于科研，不能用于人体实验或人体治疗。

操作步骤：
根据目的蛋白分子量大小选择合适的PAGE分离胶配制浓度，最佳胶浓度请参考附表1。

I 灌制分离胶(各试剂使用量请参考附表2)
1．参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。
注：加入上层筛板有助于加样时保持填料与样品均匀接触，是否加入上层筛板可根据实际情况选择。
2．将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、SDS-PAGE Separating Gel Buffer和纯水在小烧杯或试管中混合。
3．加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
4．在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液(对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5 cm或距梳齿约0.5 cm即可)， 然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1 cm的水层，使凝胶表面保持平整。
5．静置30-60分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后，表面凝胶已聚合。

II 灌制浓缩胶(各试剂使用量请参考附表3)
1、去除覆盖在分离胶上的水层。
2、将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、SDS-PAGE Stacking Gel Buffer和纯水在一个小烧杯或试管中混合。
3、加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
4、将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。
5、将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。
6、静置10~20分钟，等待浓缩胶聚合。
7、待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。
8、进行常规电泳操作。

附表1. SDS-PAGE分离胶的浓度与最佳分离范围

SDS-PAGE 分离胶浓度	最佳分离范围
6%胶	50-150 kD
8%胶	30-90 kD
10%胶	20-80 kD
12%胶	12-60 kD
15%胶	10-40 kD

附表2. 配制SDS-PAGE分离胶

分离胶浓度	凝胶体积	所需各组分体积(单位：ml)
		纯水	30%Acr-Bis(29:1)	SDS-PAGE Separating Gel Buffer(4×)	10%APS	TEMED
6%	5ml	2.75	1.0	1.25	0.05	0.004
	10ml	5.5	2.0	2.5	0.1	0.008
	15ml	8.25	3.0	3.75	0.15	0.012
	20ml	11	4.0	5	0.2	0.016
8%	5ml	2.42	1.33	1.25	0.05	0.003
	10ml	4.8	2.7	2.5	0.1	0.006
	15ml	7.25	4.0	3.75	0.15	0.009
	20ml	9.7	5.3	5	0.2	0.012
10%	5ml	2.08	1.67	1.25	0.05	0.002
	10ml	4.17	3.33	2.5	0.1	0.004
	15ml	6.25	5.0	3.75	0.15	0.006
	20ml	8.3	6.7	5	0.2	0.008
12%	5ml	1.75	2.0	1.25	0.05	0.002
	10ml	3.5	4.0	2.5	0.1	0.004
	15ml	5.25	6.0	3.75	0.15	0.006
	20ml	7.0	8.0	5	0.2	0.008
15%	5ml	1.25	2.5	1.25	0.05	0.002
	10ml	2.5	5.0	2.5	0.1	0.004
	15ml	3.75	7.5	3.75	0.15	0.006
	20ml	5	10.0	5	0.2	0.008

附表3. 配制5%SDS-PAGE浓缩胶

凝胶体积	所需各组分体积(单位：ml)
	纯水	30%Acr-Bis(29:1)	SDS-PAGE Stacking Gel Buffer(4×)	10%APS	TEMED
2ml	1.14	0.34	0.5	0.02	0.002
4ml	2.28	0.68	1	0.04	0.004
6ml	3.42	1.02	1.5	0.06	0.006
8ml	4.56	1.36	2	0.08	0.008

储存条件：2～8℃


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