北京现货肠出血性大肠杆菌溶血素荧光PCR检测试剂盒(Hly)

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。

北京百奥莱博生产销*(代"售")的北京现货肠出血性大肠杆菌溶血素荧光PCR检测试剂盒(Hly)打折促销，是高品质的细菌PCR检测试剂盒产品，欢迎的您垂询订购。

名称：北京现货肠出血性大肠杆菌溶血素荧光PCR检测试剂盒(Hly)打折促销
等级：科研试剂
产地：国产|进口
规格：48次/盒
编号：SYA087
本试剂盒适用于检测水样粪便、疑似污染的水、食物等样本中的肠出血性大肠杆菌溶血素基因，用于肠出血性大肠杆菌溶血素基因的辅助诊断，其检测结果仅供临床参考。

本试剂盒用一对肠出血性大肠杆菌溶血素(Hly)特异性引物，结合一条特异性探针，用荧光PCR技术对肠出血性大肠杆菌溶血素(Hly)核酸进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

试剂盒组成：

 

组份	数量	规格
Hly反应液(Hly-qPCR MIX)	1管	960μL/管
核酸提取液(DNA Extraction)	2管	1.5mL/管
酶混合物(EnzymHly MIX)	1管	48μL/管
阴性对照(NTC)	1管	250μL/管
Hly阳性对照(Hly-PTC)	1管	50μL/管

储存条件：-20℃以下，有效期6个月。

使用方法：

一、样品采集及处理：
1．水样便取0.5-1mL；疑似污染的食物取1g。
2．水样便13000rpm离心2min，去尽上清；疑似污染的食物用手术剪剪碎混匀后取0.05g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中；疑似污染的水直接取100μL。

二、DNA提取：
对上述处理好的样本加入等体积的核酸提取液(固体标本加入50uL核酸提取液)，100℃恒温处理10min，13000rpm离心5min，取上清液转移至新的1.5mL EP管，-20℃保存；
DNA的提取也可以采用商业化DNA提取试剂盒。
 注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接取4µL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议最后在样品制备区域加入阳性对照。

三、检测步骤：
1．试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(Hly-qPCR MIX)、酶混合液(EnzymHlyMIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：

试剂	每个反应加入的量	N个反应加入的量
荧光PCR反应液	20µL	N×20µL
酶混合液	1µL	N×1µL
总量	21µL	N×21µL

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入21μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品/阴性对照(NTC)/阳性对照(Hly-PTC)4μL，10000rpm瞬时离心10秒。
2．qPCR反应条件
将各反应管放入实时荧光PCR仪器的反应槽内。推荐循环条件：

预变性	1循环	94℃ for 2 min
PCR扩增	40循环	94℃ for 15 sec 55℃ for 30 sec

在55℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM，淬灭基团：NONE，请勿选择ROX 参比荧光。

四、结果分析：
1．结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
2．试验成立判定
➤阴性对照(NTC)：不应产生任何的扩增曲线。
➤阳性对照(Hly-PTC)：均产生扩增曲线。
➤以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效。
3．结果判定
➤在试验成立的条件下，Ct值≤35的样本为阳性，且有明显的指数增长曲线，表明肠出血性大肠杆菌溶血素(Hly)核酸阳性。
➤Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明肠出血性大肠杆菌溶血素(Hly)核酸阴性。
➤如果35＜Ct值，判为可疑样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性。
➤对于可疑阳性样品，重新抽提核酸，再次进行肠出血性大肠杆菌溶血素(Hly)qPCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明肠出血性大肠杆菌溶血素(Hly)核酸阳性；否则判为样本阴性。

五、注意事项：
➤初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
➤所有使用的离心管应高压灭菌，而且必须不含DNA酶。
➤PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等)，防止实验室污染。
➤样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。
➤试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

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等级：科研实验专用
规格：48次/盒|96次/盒
一、简介：
本试剂盒用一对猪瘟病毒特异性引物，结合一条特异性荧光探针，用一步法荧光RT-PCR技术对猪瘟病毒RNA进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。本试剂盒中猪瘟病毒的探针报告基团为FAM。

二、用途：
本试剂盒适用于猪病料、鼻咽拭子、血液等样本中的猪瘟病毒(CSFV)特异性检测。适用于猪瘟病毒(CSFV)感染的辅助诊断、监测及流行病学调查，其检测结果仅供临床参考。

三、试剂盒组成：(48T)
组份 数量 规格
猪瘟病毒荧光qRT-PCR反应液(CSFV-qRT-PCR MIX) 1管 672μL/管
酶混合物(Enzymes MIX) 1管 48μL/管
无核酸酶水(Nuclease-Free Water) 1管 500μL/管
阴性对照(NTC) 1管 50μL/管
阳性对照(PTC) 1管 50μL/管

四、储存条件及有效期：
本试剂盒于-20℃以下保存，有效期为6个月。

五、荧光PCR仪器适用范围：
ABI系列，Roche系列等荧光定量PCR检测仪等。

六、样品的采集与RNA提取
6.1 样品的采集
按照相关标准采集。标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-80℃，但不能超过6个月，标本运送应采用0℃冰壶。
6.1.1 血清：用一次性无菌注射器抽取静脉血2mL，注入无菌的干燥玻璃管，室温(22-25℃)放置30-60min，血标本可自发完成凝集析出血清，或直接使用水平离心机，3000rpm离心5min，吸取上层血清，转移至1.5mL灭菌离心管。
6.1.2 血浆：用一次性无菌注射器抽取静脉血2mL，注入含EDTA2Na(乙二*(代"胺")四乙酸二*)或柠檬酸*抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，5-10min后即可分离出血浆，转移至1.5mL灭菌离心管。
6.1.3 拭子、分泌物等样品：在装有拭子或分泌物的离心管中加入500μL PBS或生理盐水，剧烈振荡30s。棉拭子尽量挤出液体转移到无RNA酶污染的离心管中，6000rpm离心20s，取上清备用。
6.1.4 病灶组织样品：称取组织约0.1g于研磨器或组织匀浆器中研磨(最好置于冰上或加入液氮)，再加1mL生理盐水研磨至无块状物，然后将样品转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液于1.5mL灭菌离心管中。

6.2 RNA提取
可按常规方法提取，也可采用商品化试剂盒提取病毒RNA。
6.2.1 取无RNA酶的1.5 mL Eppendorf离心管，做好标识。
6.2.2 加入600μL裂解液，200μL样本，200μL*仿，混匀器上振荡5 s，4℃ 12000 rpm离心15 min。
6.2.3 吸取步骤6.2.2中的上清液转移至新的无RNA酶的1.5 mL Eppendorf离心管中(避免吸出中间层)，加入400 μL 异丙醇，颠倒混匀。
6.2.4 4℃ 12000 rpm离心15 min，弃上清；加入600 μL 75%乙醇。
6.2.5 4℃ 12000 rpm离心10 min，弃上清。打开离心管管盖，室温干燥5 min-10 min。
6.2.6 加入10μL 无核酸酶水，溶解管底的RNA，5000 rpm离心5 s，-20℃保存。若长期保存需放置-80℃冰箱。
 注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接取5µL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议最后在样品制备区域加入阳性对照。

七、检测步骤：
7.1 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光qRT-PCR反应液(CSFV-qRT-PCRMIX)、酶混合物(EnzymesMIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合液 1µL N×1µL
总量 15µL N×15µL
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加15μL，向每管中加入处理后样品/阴性对照(NTC)/阳性对照(CSFV-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qRT-PCR反应条件
将各反应管放入实时荧光PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
反转录(Reverse Transcription) 1循环 45℃ for 10 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 45 sec
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM。

八、结果分析
8.1 结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
8.2 试验成立判定
(1) 阴性对照(NTC)：不应产生任何的扩增曲线。
(2) 阳性对照(CSFV-PTC)：均产生扩增曲线。
(3) 以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效。
8.3 结果判定
(1) 在试验成立的条件下，Ct值≤35的样本为阳性，表明CSFV核酸阳性。
(2) Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明CSFV核酸阴性。
(3) 如果35＜Ct值≤40，判为可疑样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性。
(4) 对于可疑阳性样品，重新抽提核酸，再次进行CSFVqRT-PCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明CSFV核酸阳性；否则判为样本阴性。

九、注意事项
(1) 初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
(2) 所有使用的离心管最好高压灭菌，而且必须不含RNA酶。
(3) PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等)，防止实验室污染。
(4) 样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。
(5) 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。



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·常见大肠埃希氏菌多重凝胶PCR检测试剂盒(EPEC, EHEC, ETEC, EIEC, EAEC五种致泻性大肠埃希氏菌多重凝胶PCR检测试剂盒)
编号：SYA254
等级：科研实验专用
规格：48次/盒
本试剂盒可用于肠致病性(EPEC)、肠出血性(EHEC)、肠产毒性(ETEC)、肠侵袭性(EIEC)、肠粘附性(EAEC)、大肠埃希氏菌的毒力基因谱及其致病型别的检测。实验结果仅为基础研究提供参考，不作为临床诊断依据。

本试剂盒采用多重PCR技术，适用于五种致泻性大肠埃希氏菌(EPEC、EHEC、ETEC、EIEC、EAEC)的检测。试剂盒的每个反应体系均含有大肠埃希氏菌种属和毒力基因检测的十二对特异性引物，根据PCR扩增产物的条带大小来判断菌株中含有的毒力基因种类并确定其致病型别。

试剂盒组成：

英文名称	中文名称	规格	数量
PCR Mix	PCR反应液	195μL/管	5
Taq Ploymerase	Taq酶	10μL/管	3
DNA Extraction	核酸提取试剂	1.5mL/管	2
Negative Control	阴性对照	50μL/管	1
Positive Control	Ec阳性对照	50μL/管	1

储存条件：-20℃，应避免反复冻融，有效期6个月。

使用方法：

一、样品采集及处理：
➤食品样品：样品的采集与预培养按照样品的采集与预培养按照《食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验 (GB/T 4789.6-2003) 要求进行。
➤血液样品：用无菌注射器抽取受检者静脉血2mL，注入无菌EDTA2Na(或柠檬酸*)抗凝管，立即混匀。
➤粪便样品：取粪便置于灭菌的收集管中送检。
➤病灶部位样品：取发病部位新鲜渗出物、粘液脓血送检。
 注：上述样品建议经过增菌后，收集培养物用于检测。

二、DNA提取：
➤液体培养物：取培养物50μL(培养至一定浊度)或者挑取单克隆菌落加入50μL DNA提取液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL做PCR反应。
➤固体培养物：可直接挑取单克隆菌落加入到反应体系中，充分混匀。
➤血液样本：直接取200μL抗凝血，转至一洁净的1.5mL离心管中，加入1mL双蒸水，剧烈震荡30s，8000rmp离心5min，弃上清，至无明显红色沉淀(若沉淀明显，请再重复上述步骤一次)。加入1mL生理盐水，剧烈震荡15s，13000rmp离心5min，弃上清。加入50μLDNA提取液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL做PCR反应。
➤粪便样品：挑取米粒大小粪便于灭菌离心管中，加入0.5mL生理盐水，振荡混匀，13000rpm离心3分钟，弃上清。沉淀中加入50μLDNA提取液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL做PCR反应。
➤其他液体标本：取标本2-3mL，13000rpm离心3min，弃上清，沉淀中加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL做PCR反应。
 注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接取5µL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议最后在样品制备区域加入阳性对照。

三、检测步骤：
1．反应体系配置
反应体系配制：从试剂盒中取出试剂冰上融化，待试剂完全解冻，充分混匀后瞬时离心。
 注：Taq酶现用现取，尽量避免反复冻融。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：

试剂	每个反应体系的量	N个反应加入的量
Ec PCR反应液	19.5μL	N×19.5µL
Taq酶	0.5 μL	N×0.5µL
总量	20µL	N×20µL

体系分装：将上述反应液混匀后瞬时离心，进行PCR扩增。
2．PCR循环条件设置

程序	循环数	温度	反应时间
1	1	95	4min
2	35	95	40s
		62	1min 10s
		72	1min 40s
3	1	72	5min

四、结果分析：
1．对PCR扩增产物进行电泳分析
若选用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物分离鉴定，推荐使用浓度为1.5%的琼脂糖凝胶(待胶凉至不烫手时加入染料)，且胶的长度不小于10cm，在 25μL PCR产物中，加入上样缓冲液，混匀后取20-30μL混合液加入至上样孔中；电压值设定为电泳槽正负极距离(cm)与5(V/cm)的乘积；加入5-10μL Maker，同时可用阳性对照的PCR产物作为特异性分子Marker。
2．结果判定
所有大肠埃希氏菌(包括致泻和非致泻性大肠)均有一条uidA的扩增条带。在uidA条带的基础上，若有毒力基因条带的扩增，则为致泻性大肠埃希氏菌。根据DNA Marker和(或)阳性对照判断扩增条带大小，进而确定毒力基因种类，结合毒力基因组合方式判定最终致病型别，具体组合方式见下表。(注：本试剂盒检测的靶序列为保守序列。细菌在靶序列处若发生基因突变，则可能出现假阴性结果。由于毒力基因可在细菌间转移，实际检测中一株菌种可能同时存在含有源自不同型别的致泻性大肠埃希氏菌毒力基因。)

致病型	毒力基因种类 及片段大小	阳性判定结果组合
EPEC	bfpB(900bp) escV(540bp)	uidA(1500bp)+	典型:bfpB(+),escV(+),stx1(-),stx2(-) 不典型:bfpB(-),escV(+),stx1(-),stx2(-)
EHEC	escV(540bp) stx1(240bp) stx2(320bp)	uidA(1500bp)+	escV(+/-),stx1 (+),stx2 (-),bfpB (-) escV(+/-),stx1 (-),stx2 (+),bfpB (-) escV(+/-),stx1 (+),stx2 (+),bfpB (-)
ETEC	elt(650bp) estla(160bp) estlb(170bp)	uidA(1500bp)+	elt(+),estla(-),estlb(-) elt(+),estla(+),estlb(-) elt(+),estla(-),estlb(+) elt(-),estla(-),estlb(+)
EIEC	invE(760bp)	uidA(1500bp)+	invE(+)
EAEC	astA(100bp) aggR(400bp) pic(1100pb)	uidA(1500bp)+	astA, aggR, pic中一条或一条以上阳性

五、检测方法的局限性：
本试剂盒检测的靶序列为致泻性大肠埃希氏菌基因的保守区域，这些基因高度保守稳定。但如果细菌在靶序列处发生基因突变，则可能出现假阴性结果，即发生漏检；同时，样品收集、处理、运送和保存的质量均对检测结果造成影响。鉴于毒力基因可在细菌间转移，实际检测中可存在一株菌种同时含有源自不同型别的致泻性大肠埃希氏菌毒力基因的可能性。

六、注意事项：
➤初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
➤所有使用的离心管最好高压灭菌。
➤PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等)，防止实验室污染。
➤样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。
➤试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

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