北京T-Cadherin mRNA原位杂交试剂盒现货供应

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北京百奥莱博专业生产销*(代"售")北京T-Cadherin mRNA原位杂交试剂盒现货供应，我公司供应的分子生物学试剂品类齐全，且具有优势价格，欢迎新老客户垂询订购。

名称：北京T-Cadherin mRNA原位杂交试剂盒现货供应
规格：100T
产地：国产|进口
品牌：百奥莱博
编号：ZN1354
基本信息：
保存条件：4℃保存一年
工作量：100张切片。
有效期：一年。
适用种属：hμman,rat,mouse
标记方式：3’—尾段标记
试剂盒中内容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.预杂交液 2ml；
3.T-Cadherin mRNA原位杂交试剂盒寡核苷酸探针杂交液 2ml；
4.封闭液 5ml；
5.生物素化鼠抗地高*(代"辛") 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化过氧化物酶 5ml。
用户自备试剂：
原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位杂交用 PBS)
一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7•H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸馏水中加*化*17.6g，柠檬酸三*(C6H5O7Na3•2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
原位杂交用PBS(1000ml蒸馏水加*化*30g,Na2HPO4•12H2O 6g,NaH2PO4•2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：最重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖*酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖*酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗地高*(代"辛")：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲*透明，封片。
二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖*酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟,10分钟，20分钟，30分钟。以找到最佳的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。其余步骤和冰冻切片6-16步相同。
结果观察：
T-Cadherin的细胞胞浆着色呈棕黄色。
注意事项：
由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的极少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—10倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。

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抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)检测试剂盒(PNP比色法)   60T
ARB12243 大鼠血管生长素(ANG)检测服务 Rat angiogenin,ang ELISA KIT
乙二*(代"胺")四乙酸三*盐 Mutarotase 65501-24-8
SJ0719 1×pbs
ARB12354 大鼠妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)定量分析 Rat pregnancy associated plasma protein a,papp-a ELISA KIT
ARB13711 兔骨保护素(OPG)酶联免疫定量检测 Rabbit osteoprotegerin,opg ELISA KIT
4-羟基*甲*(代"酸")* 5′-UDP 114-63-6
Hanks平衡盐溶液(无酚红)  1×HBSS|5×HBSS 500ml
9001-64-3 苹果酸脱*酶 Malatedehydrogenase
ARB10711 人多药耐药相关蛋白(MRP)酶标法分析 Human multidrug resistance-associated protein,mrp ELISA KIT
环磷酸腺苷 Lithocholic acid 60-92-4
脱氧核糖核酸酶Ⅰ(牛胰) Sodium 1-propanesulfonate 9003-98-9
BL1417 "Western blotting(小鼠/兔IgG)
BL1200 卢戈碘液(革兰氏染色)
ARB12067 大鼠巨噬细胞移动抑制因子(MIF)Elisa定量检测 Rat macrophage migRation inhibitory factor,mif ELISA KIT
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·CCK-8试剂盒/Cell Counting Kit-8
编号：ZN1541
规格：100T/500T/2500T
产品用途：用于原位杂交实验中组织样本消化处理。
产品规格：1ml
保存条件：4℃避光保存，一年有效。
产品描述：按照每孔加入10μl的试剂，本产品可以用于100孔的检测。
产品说明：
Cell Counting Kit-8(简称 CCK-8)试剂盒广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测，它对细胞无明显毒性，在电子载体的作用下被细胞线粒体中的一些脱*酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。
本试剂盒检测非常便捷。试剂盒仅一管已经配制好的含有WST-8的CCK-8溶液，无须再进行任何配制等操作。无须使用同位素，所有的检测步骤仅在同一块96孔板内完成。不必洗涤细胞，不必收集细胞，也不必采用额外的步骤去溶解formazan。可以用于大批量样品的检测。
注意事项：
1．第一次做实验时，建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。
2．接种时注意细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不一致。
3．培养板周围一圈孔培养液容易挥发，为减少误差，建议培养板周围的四边每孔只加培养基。
4．建议采用多通道移液器，减少平行孔间的误差，加 CCK-8时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基液面下加，容易产生气泡，干扰OD值。
5．若细胞培养时间较长，培养基颜色或 PH 发生变化，建议更换培养基后再加CCK-8,含有酚红的培养基不影响测定。
6．CCK-8 对细胞的毒性非常低，其他的实验，例如中性红法或结晶紫法，也可在CCK-8法检测完后继续进行。
7．可以使用大于600nm的波长，例如650nm，作为参考波长进行双波长测定，CCK-8在参比波长处没有吸光值，设定参比波长的目的是为了去除由于样品浑浊所带来的吸收。
8．如果实验中待测物质有氧化还原剂，在不含细胞的培养基中加入药物，然后加入CCK-8试剂在一定时间内检测，和不加药物的培养基进行比较(只加CCK-8试剂)，如果O.D值明显偏高，则说明有反应。
9．加 CCK-8试剂时速度要快，减少试剂在移液器上的残留，加入CCK-8试剂后轻轻震培养板，为了避免加样时由于CCK-8残留在枪头上所带来的误差，可以在加样前用培养稀释CCK-8试剂并混匀后加样。
10.CCK-8 反复冻融会增加背景值，干扰实验测定。
所需材料：10μl，100-200μl以及多通道移液器
96 孔培养板
CO2培养箱
带有 450nm 滤光片的酶标仪
使用方法：
制作标准曲线
1．先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。
2．按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做 3-5 个细胞浓度梯度，每组 3-6个复孔。
3．接种后培养 2-4 小时使细胞贴壁，然后加 CCK-8 试剂培养一定时间后测定 OD 值，制作出一条以细胞数量为横坐标，OD 值为纵坐标的标准曲线，根据此标准线可以测定未知样品的细胞数量(使用此标准曲线的前提条件是实验的条件一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK-8 后的培养时间)。
细胞活性检测
1．收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，96孔板每孔加入100μl,使待测细胞调密度至(1000-10000)/孔。
2．5%CO2，37℃培养细胞24小时(培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异)。
3．每孔加入10μl CCK-8溶液。如果起始的培养体积为200μl，则需加入20μl CCK-8溶液，其它情况以此类推。
4．在细胞培养箱内继续孵育0.5-4小时，对于大多数情况孵育1小时就可以了。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定(一般情况下，白细胞较难显色，因此需要较长的CCK- 8反应时间或增加细胞数量。悬浮细胞与贴壁细胞相比较难显色。对于贴壁细胞，CCK-8的培养时间一般为1- 4小时，注意：CCK- 8的最佳反应时间以具体显色的最佳时间为准)。
初次实验时可以在0.5、1、2和4小时后分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。
5．在 450nm 测定吸光度。
细胞增殖-毒性检测
1．收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，96孔板每孔加入100μl,使待测细胞调密度至(1000-10000)/孔。
2．5%CO2，37℃培养细胞24小时(培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异)。
3．加入10μl不同浓度的待测物质，将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(例如6,12,24或48小时)。
4．每孔加入10μl CCK-8溶液。如果起始的培养体积为200μl，则需加入20μl CCK-8溶液，其它情况以此类推。
5．在细胞培养箱内继续孵育0.5-4小时，对于大多数情况孵育1小时就可以了。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定(一般情况下，白细胞较难显色，因此需要较长的CCK- 8反应时间或增加细胞数量。悬浮细胞与贴壁细胞相比较难显色。对于贴壁细胞，CCK-8的培养时间一般为1- 4小时，注意：CCK- 8的最佳反应时间以具体显色的最佳时间为准)。
初次实验时可以在0.5、1、2和4小时后分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。
6．在 450nm 测定吸光度。
注意：如果待测物质有氧化还原性，可在加 CCK-8 之前更换新鲜的培养基，去掉待测物质的影响。
计算公式：
细胞存活率= [(实验孔-空白孔)/(对照孔-空白孔)]×100%
抑制率= [(对照孔-实验孔)/(对照孔-空白孔)]×100%
实验孔(含有细胞的培养基、CCK-8、待测物质)
对照孔(含有细胞的培养基、CCK-8、没有待测物质)
空白孔(不含细胞和待测物质的培养基、CCK-8)


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