北京IL2R mRNA原位杂交试剂盒说明书

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北京百奥莱博专业生产销*(代"售")北京IL2R mRNA原位杂交试剂盒说明书，我公司供应的分子生物学试剂品类齐全，且具有优势价格，欢迎新老客户垂询订购。

名称：北京IL2R mRNA原位杂交试剂盒说明书
产地：国产|进口
品牌：百奥莱博
编号：ZN0730
规格：100T
基本信息：
保存条件：4℃保存一年
工作量：100张切片。
有效期：一年。
适用种属：hμman
标记方式：3’—尾段标记
试剂盒中内容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.预杂交液 2ml；
3.IL2R mRNA原位杂交试剂盒寡核苷酸探针杂交液 2ml；
4.封闭液 5ml；
5.生物素化鼠抗地高*(代"辛") 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化过氧化物酶 5ml。
用户自备试剂：
原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位杂交用 PBS)
一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7•H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸馏水中加*化*17.6g，柠檬酸三*(C6H5O7Na3•2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
原位杂交用PBS(1000ml蒸馏水加*化*30g,Na2HPO4•12H2O 6g,NaH2PO4•2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：最重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖*酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖*酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗地高*(代"辛")：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲*透明，封片。
二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖*酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟,10分钟，20分钟，30分钟。以找到最佳的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。其余步骤和冰冻切片6-16步相同。
结果观察：
IL2R的细胞胞浆着色呈棕黄色。
注意事项：
由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的极少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—10倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。

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·地高*(代"辛")标记探针检测试剂盒Ⅱ(AP)
编号：ZN1517
规格：1盒
保存条件：-20℃冰冻保存。
保存期：一年
用途：用于 DNA 探针的随机引物标记及各种膜上杂交和原位杂交。
工作量：可用于 1000 张切片的原位杂交或 12次 10×10cm 膜上杂交检测。
原理：
所谓 DNA 探针，实质上是一段已知的基因片段，应用这一基因片段即可与待测样品杂交。如果靶基因和探针的核苷酸序列互补，就可按碱基配对原则进行核酸分子杂交，从而达到检查样品基因的目的。在随机引物法标记反应液中，有随机合成的六 聚 体 核 昔 酸(hexanucleotide)作 为引 物 ,dATP 、 dCTP 、 dGTP 、 dTTP和D1G-11-dUTP 作为合成底物，以单链 DNA 作为模板，在 Klenow 酶的作用下，合成掺入地高*(代"辛")的DNA 链。以地高*(代"辛")标记的探针与靶基因 DNA 链杂交后，再通过免疫反应来进行检测。一般通过酶标抗地高*(代"辛")抗体来检测，就可以肯定杂交反应的存在。
免疫检测一般用碱性磷酸酶系统，BC1P/NBT 显色。敏感性很高。可用于膜上杂交和原位杂交。
试剂盒内容：
1．Anti-DIG-AP Conjugate,100μl
2．BCIP/ NBT Stock Solution,1ml
3．Blocking Reagent,5g
特点：
(1)标记属高效标记反应。以 1μg DNA 探针为例，1 小时反应即可产生 0.8μg标记探针，20 小时可产生 2μg 左右的标记探针。
(2)试剂将标记反应所需的引物、核苷酸、DIG-11dUTP和 Klenow 酶等混合在一起。一次标记只需吸取一次标记液，使用至为简便。
(3)标记反应适于下述对象：
a.DNA 从 10ng—3μg。
b.不等的DNA 长度 100bp—10kb。
c.线形排列或呈高度卷曲之 DNA。
d.低融点琼脂中的DNA。
(4)检测系统抗体为抗地高*(代"辛")单抗，标记碱性磷酸酶。效价 1：5000(膜上杂交)或 1：500(原位杂交)。
(5)显色剂为BCIP/NBT，两种成分混合后保存于 67%DMF 中，非常稳定。用时 1：50 稀释。
(6)试剂盒敏感性达到 0.1pg，足够检测出 1μg 基因组 DNA 中的单个基因。
(7)除用于各种膜上杂交之外，还可用于原位杂交(ISH)。
操作程序：
一 随机引物标记操作程序如下：
①用灭菌去离子蒸馏水稀释 1μg DNA 至总体积 16μl。
②DNA 热变性：把 DNA 瓶置于沸水中，水浴 10分钟。然后，迅速地插入碎冰中 3分钟以上。
③加 4μl DIG Random Labeling Mix(高效),混匀后再离心 2000/r.p.m×5分钟。
④置 37℃反应至少 120分钟。时间越长，产量越高。延长反应时间至 20 小时可明显增加地高*(代"辛")标记DNA的产量。应根据需要控制反应时间。
⑤加入 2μ 1 10mM EDTA 以中止反应，对于原位杂交和膜上杂交反应来说，标记反应可告结束，上述反应液置-20℃保存至少一年以上。且可反复使用。
二 核酸探针膜上杂交原理和操作
(一)杂交总原则
脱氧核苷酸通过磷酸二酯键缩合成长链构成 DNA的一级结构。两条碱基互补的多核苷酸链按碱基配对原则形成双螺旋，构成 DNA的二级结构。某些条件(如酸碱、有机溶剂、加热)可使*键断裂，DNA 双链打开成单链重新结合。所谓杂交，是具有一定互补顺序的核酸单链，DNA 单链仍然可与序列同源的单链按碱基互补原则结合成异源性双链的过程。
(二)杂交膜的选择
杂交膜可以选择硝酸纤维素膜和尼龙膜。硝酸纤维膜的优点在于本底较低，但只能用于显色性检测，且不能用于重复杂交。尼龙膜分为带正电荷的膜和不带电荷的膜两种。带正电荷的尼龙膜对核酸结合力强，敏感性也较高。不带电荷的膜结合力低，相应敏感性也较低。尼龙膜的优点在于杂交用过的膜，用洗脱液(0.1×SSC，0.1%SDS)煮沸 5-10分钟后去除探针，可用于新的探针杂交。如果对杂交结果不满意，如背景太高或显色不强，也可洗去探针之后重新杂交。
(三)探针浓度
探针浓度是获得理想杂交检测的关键因素，浓度太高则会导致本底太深；若浓度太低又会导致信号减弱。为了解决过高探针浓度所引起的高背景，必须进行模拟杂交实验。
所谓模拟杂交实验，即选择几小片杂交膜，在未转移 DNA的情况下，进行封闭、不同浓度的探针孵育及随后的免疫检测。以背景能被接受的最高探针浓度为正式杂交实验的浓度。模拟杂交实验不同浓度的探针可以参考下述方法配制：取 5μl 标记反应液加 1ml 探针稀释液，混匀。取 0.5ml 等倍释后，再取 0.5ml 继续等倍稀释。
假设 20μl 标记反应液中含 1μg 标记的探针，则系列稀释探针的浓度分别是：
200ng/ml、100nt/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml。
(四)预杂交和杂交液
预杂交和杂交都使用相同缓冲液，不同的仅是预杂交液中不含有探针。下面是几种基本杂交液配方：
① Standard buffer ：5 × SSC,0.1%(w/v)N-Lauroylsarcosine,0.02%(w/v)SDS,1% Blocking Reagent。
② Standard buffer+50% formamide∶50% formamide(deionized),5×SSC,0.1%(W/V)N-Lauroy lsarcosine,0.02%(w/v)SDS,1% Blocking Reagent。
③ High SDS buffer(Church buffer):7%SDS,50% formamide(deionized),5×SSC,2% Blocking Reagent,50mM Sodiμm Phosphate,0.1% N-Lauroylsarcosine
(五)Southern Blotting 
DNA 片段经电泳分离后按分子量大小排列在琼脂糖凝胶上。1975 年 Southern 发明了利用浓盐溶液的推动作用将变性的单链 DNA 转移到硝酸纤维素膜上的方法，解决了原位转移的问题。虽然其原理和操作均很简单，却是基因分析中必不可少的手段，已经得到了广泛的应用。 Southern 印迹杂交包括两个主要步骤①把电泳分级的DNA 转移到固相支持膜上。②与标记的DNA 探针杂交。
1．Southern 转移
首先将 DNA 用限制性内切酶消化。准备一定浓度的琼脂凝胶。琼脂凝胶必须是高纯度和核酸级的。电泳后经*化乙锭染色并在紫外灯下照相后，将需要转移的琼脂糖凝胶切下，放入搪瓷盘中，然后进行下面的步骤。
试剂
a.0.25M HC1
b.变性液：0.5N NaoH,1.5M Nac1
c.中和液：0.5M Tris-HC1,pH7.4,3M Nac1
d.20×SSC：0.3M 柠檬酸*,3M Nac1。
e.2×SSC：0.03M 柠檬酸*,0.3M Nac1。
程序：
(1)将胶浸入 0.25M HC1 中 10分钟。HC1 处理的作用主要是通过去嘌呤使 DNA分子断裂，因而有利于高分子量 DNA的转移，但不能处理时间过长。要转移全部小于 10kb的DNA 片段时可省略此步骤。
(2)进入变性液之前，用蒸馏水漂洗20-30分钟。
(3)把胶浸入变性液中，室温浸泡 15分钟×2次。
(4)蒸馏水漂洗凝胶 2次。
(5)把胶浸入中和液中，室温泡 15分钟×2次。
(6)在处理凝胶的同时，切一张与胶同样大小的尼龙膜或硝酸纤维膜。硝酸纤维膜用 2×SSC 浸泡。
剪两张 Whatman3#滤纸和一叠吸水用的粗滤纸注意不能用手指直接触及膜面。
(7)准备转移用平器和支架，平器中放 20×SSC。架子上搭滤纸桥使溶液能够虹吸上来。
(8)依次放：处理好的凝胶，硝酸纤维素膜，吸水滤纸，玻璃板，适量重物(500-1000g)
(9)注意：要检查 PH 值，用硝纤膜时 PH<9。要确保各层间没有气泡，否则会发生局部“绝缘”，气泡处的DNA 难以被吸到硝酸纤维膜上。
(9)于室温转移 12-20 小时。
(10)取出转移膜，用 2×SSC 漂洗数次，以去掉可能粘附于膜上的凝胶。
(11)固定：可选择下述方法之一进行 DNA 固定
·紫外线固定：使用长波紫外线照射 10-20分钟，简单漂洗后干燥备用。
·尼龙膜置+120℃烘烤 30分钟。
·硝纤膜置真空烤箱中，80℃减压烘烤 2-2.5 小时，以避免硝纤膜自熔。若无真空烤箱，
亦可在普通烤箱中 65-70℃烘烤 3-4 小时，也能达到固定目的。固定后，将膜封于塑料袋中，保存于干燥处待杂交。
注意事项：
①转移液的盐浓度对转移具有一定影响。一般选择 20×SSC 快速转移。
10×SSC 转移速度较慢，对于高分子量 DNA(〉10Kb)效果比较理想。因此要根据不同目的选择适当的转移液。
②转移时不能移动上边重物，防止出现“重影”现象。
③硝酸纤维膜对于 0.5kb 以下的小分子 DNA 结合不牢，转移时容易丢掉。要探测小片时最好用尼龙膜。

2 ．Southern 印迹杂交杂交成功的关键因素之一在于选择杂交液。应通过预实验来选择合适的杂交液。另一个比较重要的因素是标记探针的浓度，一般选择 5-25ng/ml，应通过模拟杂交实验来选择合适的探针浓度。
试剂
a.Standard buffer
b.Standard buffer+50% formamide
c.High SDS buffer
d.Wash Solution I:2XSSC,0.1%SDS
e.Wash Solution Ⅱ:0.5XSSC,0.1%SDS
程序
①将转移好的尼龙膜或硝纤膜装入塑料袋中，每边各留 2-4mm 空隙。灌注杂交液的一边留 1cm 空隙。在角上剪开一个小口，灌注预杂交液，从切口处赶走气泡，用封膜机封口，浸入水浴中。
②根据所选择的不同预杂交液，采用不同的温度预杂交 4-20 小时：Standard buffer:
预杂交温度 65-68℃ ,Standard buffer+50% formamide:37-42℃ ,High SDS buffer:37-42℃。
③使用双链 DNA 探针时，沸水浴 10分钟以变性探针。然后迅速插入冰中。
按模拟杂交实验所确定的探针浓度将适量探针加入到预杂交液中，配成杂交液，一般浓度 5-25ng/ml。按每100cm2 膜加入至少 3.5ml 配制杂交液。
④使用和预杂交相同的杂交温度，一般杂交 16-20 小时。
⑤杂交结束后，取出杂交袋，剪开一个小口，将杂交液倒入带盖的试管中，储存于-20℃以备下次使用。这样至少可保存一年。再次使用之前应在冻融之后，加热至+95℃
10分钟以变性探针。杂交液如含有 50%甲酰胺，则在 68℃变性 10分钟即可。
⑥取出杂交膜，用 Wash Solution I洗5分钟×3次。
⑦保温冲洗：用 Wash SolutionⅡ于 68℃冲洗15分钟×2次。
(六)· DNA Dot Blotting 
此检测方法用于快速定性筛选 DNA。样品可以是纯化 DNA，也可以是细胞碎片 PCR扩的DNA。预杂交和杂交方法与 Southern 基本一致，不同的仅是样品的处理不同。
试剂：DNA dilution buffer∶10mM Tris-HC1；1mM EDTA,PH8.0；50μg/ml herring Sperm DNA
程序：
①将样本 DNA 稀释成不同浓度。
②将样本 DNA 于+95℃水浴 10分钟，迅速插入冰中。
③取 1μl 点样至尼龙膜或硝纤膜上。点样前先画上圆卷做记号。
④用紫外线照射固定或+120℃烘烤 30分钟固定。
其后杂交步骤 Southern 相同
(七)BCIP/NBT 显色检测法
试剂：a.Anti-DIG-AP 碱性磷酸酶标记抗地高*(代"辛")单抗体。
b.BC1P/NBT 储备液：
c.冲洗液：0.1M Tris-HC1,0.15M Nac1,PH7.4。
d.封闭液：1% Blocking Reagent/0.1M Tris-HC1,0.15M Nac1。
e.显色缓冲液：0.1M Tris-Hcl,0.1M,Nacl,PH9.5。
f.TE 缓冲液：10mM Tris,1mM EDTA,PH8.0
程序：
①经过杂交及杂交后的冲洗之后，膜置于冲洗液中平衡 1分钟。
②用干净的杂交袋或平皿，封闭液室温封闭至少 60分钟。
③用封闭液(d)1：2500—5000 稀释 Anti-DIG-AP，例如 2μl Anti-DIG-AP 加至 5—10ml封闭液中(根据染色情况而调整)。稀释液+4℃可稳定 12小时左右。
④加 Anti-DIG-AP，37℃反应 60分钟。
⑤用冲洗液冲洗15分钟×3次，每次 100ml。
⑥按 1：50 配制底物显色液：例如 100μl“BCIP/NBT 储备液”(b)加至 5ml 显色缓冲液中，未用完的显色剂应避光保存。
⑦显色缓冲液 20ml 平衡 2分钟后倾掉。
⑧加 10ml 底物显色液(100 cm2)。将膜及显色剂封在塑料袋中，开始避光显色。显色过程中可以观察。一般数分钟即开始出颜色，显色过程可以持续至 12 小时。应绝对避免振动，以免出现显色带的移位。
⑨当所需要的显色点或带出现之后，蒸馏水洗以中止反应。结果可以进行照相记录；也可以直接保存于 TE 缓冲液(f)，在此情况下，颜色长期不退。还有一种选择是让膜干燥，颜色消退。但若将膜放置于 TE 缓冲液中，显色重新出现。
三 原位杂交
所谓原位杂交是指在保存染色体、细胞或组织结构的前提下，用探针定位检查出相关基因序列。结合免疫细胞化学，原位杂交可以揭示出基因在 DNA、mRNA 水平的表达。
原位杂交技术最早 Pardue and Gall和 John etal。分别在 1969 年发现。最初，放射性标记技术是唯一的方法，其使用受到明显限制。由于非放射性标记技术的简单、高敏感性，为原位杂交技术广泛应用开避了道路。
(一)染色体原位杂交的一般技术
1 玻片准备
为了展开染色体，酒精清洁玻片即可。但为了防止细胞和组织的脱落，必须用多聚赖*酸或 APES 处理玻片。
2 固定
为了保存形态结构，生物材料都必须予以固定。染色体的固定比较简单，甲醇/乙酸固定即已足够。如果是石蜡包埋组织，采用福尔马林固定。冰冻切片采用 4%甲醛或 Bouin"s 固定液固定 30分钟。应予注意的是，DNA和 RNA 虽然不和各种交联剂反应。但包围 DNA.RNA的各种蛋白质和交联剂反应后，就会遮盖住靶核苷酸。因此，必须采取各种增加通透性的程序。
3 玻片上材料的预处理
a．内源性酶的灭活
如果用酶作为标记物，内源性酶必须预先予灭活。如过氧化物酶，可用 1%H2O2/甲醇 30分钟处理。至于碱性磷酸酶，由于杂交过程的破坏，残余碱性磷酸酶的活力会完全消失。
b.RNA 酶的处理—DNA-DNA 杂交时需要处理内源性 RNA。
内源性 RNA的存在，会由于 DNA-RNA的杂交而增加背景。处理方法：DNase-free RAase(100μg/ml)/2×SSC,37℃孵育60分钟。(SSC=150mM Nac1,15mM Sodiμm Citrate,PH7.4)
c.HC1处理用 200mM HC1处理 20-30分钟可以增加信/噪比值，其机理尚不清楚。
可能与蛋白的抽提和部分功能核苷酸片断的溶解有关。
d.去垢剂处理
在脂膜成分未被固定，脱水、包埋等程序抽提时，可以进一步使用去垢剂处理，如Triton X-100,Sodiμm dodecyl Sulfate 等，同样有助于原位杂交技术。
e.蛋白酶消化
蛋白酶消化有助于增进探针和核苷酸之间的接触性。消化通常用蛋白酶K，溶于20mM Tris-HC1,2mM Cac12，PH7.4 ,37℃ 15-30分钟。蛋白酶 K 浓度依不同对象来确定。
例如对染色体和核的分离部分，可以用 1μg/ml 蛋白酶 K。
4 探针和靶基因的变性
对染色体 DNA的原位杂交，必需进行变性处理。热变性越来越常用，它不仅简单，而且效果很好。对不同的杂交，应试验不同的时间和温度，以找到最佳的变性条件。
热变性时，探针和靶基因可以同时变性。将探针加到玻片上，盖上盖玻片。玻片放到 80℃，2分钟后取出冷却至 37℃。如果是组织切片，变性时间应达到 80℃10分钟
5 杂交后的冲洗
标记探针能够和其序列具有部分同源性的基因非特异性的杂交。这类杂交分子的稳定性总是不及完全同源的杂交分子。分别用不同强度冲洗液可以有效地洗掉非特异杂交的/探针，而保留特异杂交的探针。冲洗液的强度可通过改变甲酰胺浓度、盐浓度和温度来控制。通常用 2×SSC＋50%甲酰胺来冲洗。有时可用更高强度的冲洗液。
总的来说，杂交时用高强度缓冲液，冲洗时用低强度的冲洗液(盐浓度越低，甲酰胺浓度越高和温度越高，则冲洗强度越大)。
6 免疫细胞化学
免疫细胞化学和常规方法一样，必须先进行非特异性的封闭处理。如探针为地高*(代"辛")标记时，Tris-HC1 缓冲液含“Blocking Reagent”。此外 0.4M NaCl的加入也有助于降低背景。在标准的免疫反应程序中，先对染色体、细胞和组织进行封闭，然后用酶标抗体 37℃反应 30分钟(或室温 1-2 小时)。此后用含 Tween 20的缓冲液进行三次冲洗每次 5-10分钟。免疫细胞化学中最常用的酶是过氧化物酶和碱性磷酸酶。
前者用 DAB 作显色剂。后者用 BCIP/NBT 作显色剂，方法同膜上杂交。显色强度由显微镜下控制。
7 影响原位杂交的主要因素
a.探针长度：原位杂交和其它杂交方法不同，它要求较短的探针。因为探针越短，渗透性越强，可以渗透至细胞内部和染色体。不同的杂交所允许的最小核苷酸如下述公式所计算：
b.探针浓度：浓度越高，则杂交速度越快。但过高的浓度也会使背景增加，因此，宜选择可接受背景的最高探针浓度。
c.硫*(代"酸")萄聚糖：在水溶液中，硫*(代"酸")萄聚糖是高度水化物质，因此使得大分子(如探针)难以接触到其结合水，相对浓度大大增加，杂交速度明显加快。
d.碱基错配：碱基错配会引起杂交速度及二倍体的稳定性下降。因此在严格的杂交条件下，可以阻止探针与靶基因的非特异结合。
e.冲洗条件
8 杂交标准条件
适于 DNA 探针＞100bp
⊙50%去离子甲酰胺
⊙2×SSC
⊙50mM NaH2PO4/Na2HPO4,PH7.0
⊙1mM EDTA
⊙载体 DNA：鲑角精子 DNA 100-250ng/μl。
任选组合：
1×Denhardt`s
dextran sulfate,1-10%
温度 37-42℃
杂交时间：5-16 小时
(二)组织切片的原位杂交
目前，原位杂交已成病理学的一个有力工具，原位杂交可以用于诸如病毒，癌基因，基因突变等领域的检查。尤其是非放射性标记探针技术，为更多的实验室广泛应用原位杂交创造了条件。对福尔马林固定、石蜡包埋切片的原位杂交，关键是以下三个步骤：
①靶 DNA的暴露。这要靠精心设计的消化步骤。
②DNA的变性和杂交。
③杂交的分子的冲洗和检测。
1 探针的准备
2 玻片的处理
①去污剂浸泡一晚，大量自来水冲洗，然后用蒸留水清洗。
②干燥之后，浸入丙*(代"酮")中 3分钟。
③玻片移入 1：50 丙*(代"酮")稀释的APES 溶液中，浸泡 5分钟。
④玻片用蒸馏水略加清洗。干燥备用。处理后的玻片置干燥无尘环境可保存半年。
玻片也可用“多聚赖*酸”处理。
3 组织切片的准备
①组织用常规 4%中性缓冲甲醛溶液固定，石蜡包埋。
②常规切片。切片捞于涂有粘片剂的玻片上。
③切片处理：先置 60℃烘片 30分钟。
二甲*脱蜡，逐级酒精至水清洗。
④临用前配制蛋白酶 K 溶液：
储备液：Proteinase K,10mg/ml H2O，小量分袋-20℃保存。将储备液用 TES 稀释成100μg/ml。(TES=5mM Tris-HC1,10mM EDTA,10mM Nac1,PH7.4)
⑤每张切片用 Proteinase k 20-30μl 37℃消化 15分钟。消化过程中加盖硅化盖玻片，并置湿盒中。注意消化对组织原位杂交是至关重要的。过度消化会导致切片消失殆尽，消化不足则敏感性不够，因此应针对不同组织尝试不同的消化条件。
4 杂交
①蛋白 K 消化后，去除盖玻片。用 4%甲醛 4℃固定 5分钟。
②蒸馏水洗5分钟。
③让切片上水分滴下去，并在室温干燥 5分钟。注意只能让切片上水份减少，不能让切片完全干燥。④每张切片加 5-10μl 探针(大切片需相应增加)。
⑤设立严格的对照组，每张切片加 5-10μl不加探针的杂交液。
⑥切片上加硅化盖玻片，将玻片置+95℃变性6分钟。
⑦把玻片放到冰上 1分钟。
⑧切片置温盒，42℃杂交3小时以上。如果方便，应杂交过夜。
5 冲洗
去掉盖玻片，按下述程序冲洗
2×SSC洗5分钟×2次(室温)
0．1×SSC洗10分钟(42℃)
6 杂交分子的检测---BCIP/NBT
①切片置于 0．1M TBS 缓冲液中，PH7．4
②每张切片加 20-40μl 封闭液：0．5%Blocking Reagont/0.1M TBS。
③室温反应 15分钟。
⑤用封闭液 1：500 稀释 Anti-DIG-AP；(临用之前才配，配好后立即加至切片)
⑥每张切片加 20-50μl 稀释试剂，湿盒室温反应 1-2 小时。
⑦用 0．1M TBS洗10分钟×3次
⑧用 0．2M Tris-HC1,10mM MgC12,PH9.2 平衡5分钟。
⑨配显色剂：将 BCIP/NBT 储备液用上述缓冲液 1：50稀释。每张切片加20μl，置黑暗处显色。显色快时，一般30-60分钟。信号弱时显色过夜。
(三)细胞的原位杂交
下面的程序是用标记DNA 探针来检测培养细胞中的mRNA。其它类型的检测可以参照此程序进行。
1 细胞准备，固定和增加通透性
注意：所有溶液都必须用 RNase 抑制剂处理。
①玻片用多聚赖*酸处理。直接用 5% CO2 在玻片上培养细胞。所用培养基为无酚红 Dulbecco"s 基础培养基。
②37℃PBS 清洗细胞。然后用下述固定液室温固定 30分钟：4%甲醛，5%乙酸和0．9%NaC1。③室温 PBS 清洗固定细胞，用 70%乙醇储存于 4℃④杂交前用下述方法脱水：
70%，90%和 100%乙醇；10%二甲*；然后再用 100%，90%，70%乙醇，最后 PBS洗二次。
⑤用胃蛋白酶消化细胞：0.1%Pepsin/0.1N HC1,37℃5-10分钟。
⑥PBS洗5分钟后，1%甲醛固定 10分钟。PBS洗。
2 杂交
①地高*(代"辛")标记探针。
②杂交液配制：60%去离心甲酰胺，0．3M NaC1，30mM柠檬酸三*，10mM EDTA，25mM Na2HPO4(PH7.4)，5%硫*(代"酸")萄聚糖，250ng/μl鲑角精子 DNA。
③于80℃10分钟变性标记探针，然后加至上述杂交液中，浓度为5ng/μl
④加 10μl杂交液至玻片上，并盖上盖玻片。注意：也可选择原位变性步骤，这样可增加 RNA和探针的接触性。
⑤37℃杂交16小时。
3洗涤
杂交后去掉盖玻片，于下述溶液中充分洗涤：60%甲酰胺，300mM NaCl，30mM 柠檬酸*。室温洗三次，37℃洗一次。然后 PBS洗5分钟。
4 免疫检测
①用下述缓冲液作非特异性的封闭：0．5%Blocking Reagent/0.1M TBS，加盖玻片。
室温 15分钟。②用封闭液 1：500 稀释 Anti-DIG-AP(临用之前才配，配好后立即加至切片)。
③每张切片加 20-50μl 稀释酶标试剂，置湿盒室温反应 1-2小时。
④用 0．1M TBS洗10分钟×3次。
⑤用 0．1M Tris-HC1．0．1M Nac1，50mM Mgc12，PH9.5 平衡约 5分钟。
⑥显色剂配制：将 BC1P/NBT 储备液用上述缓冲液 1：50 稀释。每张切片加 20μl，置黑暗处显色，一般显色 30-60分钟。信号弱时显色过夜。


北京IL2R mRNA原位杂交试剂盒说明书关键词：百奥莱博,ZN0730,IL2R mRNA原位杂交试剂盒


·CXCR1 mRNA原位杂交试剂盒
编号：ZN0348
规格：100T
基本信息：
保存条件：4℃保存一年
工作量：100张切片。
有效期：一年。
适用种属：rat
标记方式：3’—尾段标记
试剂盒中内容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.预杂交液 2ml；
3.CXCR1 mRNA原位杂交试剂盒寡核苷酸探针杂交液 2ml；
4.封闭液 5ml；
5.生物素化鼠抗地高*(代"辛") 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化过氧化物酶 5ml。
用户自备试剂：
原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位杂交用 PBS)
一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7•H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸馏水中加*化*17.6g，柠檬酸三*(C6H5O7Na3•2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
原位杂交用PBS(1000ml蒸馏水加*化*30g,Na2HPO4•12H2O 6g,NaH2PO4•2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：最重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖*酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖*酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗地高*(代"辛")：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲*透明，封片。
二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖*酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟,10分钟，20分钟，30分钟。以找到最佳的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。其余步骤和冰冻切片6-16步相同。
结果观察：
CXCR1的细胞胞浆着色呈棕黄色。
注意事项：
由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的极少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—10倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。


北京IL2R mRNA原位杂交试剂盒说明书关键词：百奥莱博,ZN0730,IL2R mRNA原位杂交试剂盒


·prkg1 mRNA原位杂交试剂盒
编号：ZN1177
规格：100T
基本信息：
保存条件：4℃保存一年
工作量：100张切片。
有效期：一年。
适用种属：rat
标记方式：3’—尾段标记
试剂盒中内容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.预杂交液 2ml；
3.prkg1 mRNA原位杂交试剂盒寡核苷酸探针杂交液 2ml；
4.封闭液 5ml；
5.生物素化鼠抗地高*(代"辛") 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化过氧化物酶 5ml。
用户自备试剂：
原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位杂交用 PBS)
一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7•H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸馏水中加*化*17.6g，柠檬酸三*(C6H5O7Na3•2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
原位杂交用PBS(1000ml蒸馏水加*化*30g,Na2HPO4•12H2O 6g,NaH2PO4•2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：最重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖*酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖*酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗地高*(代"辛")：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲*透明，封片。
二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖*酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟,10分钟，20分钟，30分钟。以找到最佳的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。其余步骤和冰冻切片6-16步相同。
结果观察：
prkg1的细胞胞浆着色呈棕黄色。
注意事项：
由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的极少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—10倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。

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