大肠杆菌BL21 Star(DE3)化学感受态细胞

大肠杆菌BL21 Star(DE3)化学感受态细胞来源于 BL21(DE3)菌株，由特殊工艺制作，使用 pUC19质粒检测本产品，转化效率可达 107cfu/μg。
BL21 Star(DE3)菌株的特点是含有 rne131 基因突变体。rne131 突变基因能够增强菌株细胞内 mRNA 的稳定性，从而有效提高蛋白表达能力。本产品主要适用于 T7 启动子表达载体(如 pET 系列)的高水平蛋白表达。
菌株基因型为：F- ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm rne131(DE3)



大肠杆菌BL21 Star(DE3)化学感受态细胞本产品的主要优势是:
1. 一步式裂解细菌，比传统的碱变性方法更快捷 20 分钟以上。
2. 产量跟经典碱变性法相当，产率一般为 3-5 ug 质粒 DNA/mL 饱和菌液（对高
拷贝质粒而言）。
3. 所得质粒 DNA 呈超螺旋结构的比例比碱变性法更高。
4. 基因组 DNA 污染少。但由于操作太快，溶液中的 RNase 来不及降解 RNA，一
般会有少量 RNA 污染。
5. 可以直接用于电泳、酶切、PCR、细菌转化、分子克隆、测序等实验。 规格及成分 成份 编号 大纸盒包装
溶液 A 70903a 35 mL
离心吸附柱 60911 50 套
专用洗柱液 70903b 50 mL
DNA 洗脱液 2.0 111205 10 mL
使用手册 70903sc 1 份
运输及保存 常温运输及保存，溶液 A 长期保存需要放 4℃，有效期一年。 自备试剂 无
使用方法 1. 用塑料离心管收集不超过 3mL 过夜培养的饱和新鲜菌液，室温 12000-15000 g
离心半分钟，弃上清（培养基）。注意:不能超过 3 mL 菌液，否则质粒回收率将
急剧降低。必须使用新鲜菌液，不能使用冻存的细菌沉淀和静置的细菌培养液。
2. 加入 0.7 mL 溶液 A，充分吹打或振荡裂解细菌直到裂解变澄清，一般需要半分
钟左右。注:此方法不同于碱裂解法，此步需要充分吹打，使基因组 DNA 断裂。
3. 将裂解液全部转移到离心吸附柱中，不需要静置，直接进入下一步。
4. 室温 14000-15000 rpm 离心 2-5 分钟，弃穿透液。一般菌液越多需要离心的
时间就越长。如果还有少量液体不能离心过柱，还可以延长离心时间直到所有液
体成功过柱。如果离心速度低于 14000rpm，需要的离心时间会更长。需要注意
有的离心机标注的离心速度跟实际的速度不符合，这种情况下，可以使用离心机
的最大离心速度离心。
5. 在离心吸附柱中加入 0.7 mL 的通用洗柱液，室温 12000rpm 离心半分钟，弃穿
透液。
6. 再在离心吸附柱中加入 0.3 mL 的通用洗柱液，室温 12000rpm 离心半分钟，弃
穿透液。
7. 室温 12000rpm 离心半分钟，甩干残留液体。注意：此步不能省略，否则残留
乙醇会影响后续的电泳上样（DNA 沉不到加样孔里去）和酶反应。
8. 将离心柱置于一个新的 1.5 mL 自备塑料离心管中，加入 30-100 uL DNA 洗脱
液 2.0。
9. 室温 12000-15000 g 离心半分钟，离心管底溶液即质粒 DNA，可以直接用于后
续实验或放冰箱长期保存。
注意：此方法没有使用剧烈的碱变性，质粒 DNA 收到的伤害小，因此所得的质粒呈
现天然的超螺旋结构的比例较大，这使得酶切效率比非超螺旋质粒稍低，但常规的 1
小时酶切一般都足够将超螺旋质粒切开。
此外，此方法没有使用可以降解 RNA 的 NaOH（常规碱变性质粒使用了 NaOH），所
用溶液虽然含有 RNase，但由于整个操作非常快速，RNase 都来不及把细菌的内源
RNA 彻底降解，所以得到的质粒 DNA 往往有少量 RNA 的污染，这些污染会让 OD
值虚高，因此不建议使用测 OD 的方法确定 DNA 的浓度，最好采用电泳的方法跟浓
度已知的 DNA marker 比较来确定浓度。残留的 RNA 污染一般不影响电泳、酶切和
测序。如果需要彻底去除 RNA 污染，则需要在每次加入专用洗柱液后，室温放置 2-5
分钟，让其含有的 RNase 充分降解结合在膜上的 RNA，离心时降解成小片段的 RNA
就穿透到收集管，结合在膜上的 DNA 就更纯净。 疑难解答 可能出现的问题 可能原因 建议解决方法
质粒 DNA 产量低
抗菌素失活使质粒
部分丢失
增加抗菌素的用量
细菌裂解率低
在加入溶液A后细菌沉淀没有
充分混匀，可漩渦振荡使之充
分混匀，不要有块状物。
细菌培养物生长时
间过长或不新鲜
37℃培养时间不要超过 16
小时，不要在分离质粒前长时
间存放细菌培养物。
洗脱 DNA 时管底有白
色沉淀
细菌中污染了真菌 重新培养细菌
OD260/280 不到 1.8
细菌量过多 勿使用超过 3mL 的饱和菌液
蛋白质污染 可以用通用预洗液洗三次
背景资料 质粒 DNA 纯化技术简述
碱裂解法质粒 DNA 纯化技术是 1979 年由 Birnboim & Doly 发明、现在仍然被
广泛采用的经典技术。其第一步是细菌重悬。重悬液成份是 25 mM Tris-C（l pH 8.0）、
50 mM 葡萄糖和 10 mM EDTA。其中 Tris-Cl 用于缓冲 pH 以稳定 DNA 结构；葡
萄糖用于保持渗透压和缓冲 pH，防止基因组 DNA 过度断裂；EDTA 用于鰲合二价金
属离子，使细胞更易破碎，也使 DNase 失活，有利于保持质粒 DNA 的完整性。第二
步是碱裂解。碱裂解液的成分是 1% SDS 和 0.2 M NaOH。SDS 和 NaOH 的第一
个作用是使细胞裂解释放菌体内容物。NaOH 的第二个作用是使体系的 pH 保持在
12.0-12.5 之间,在此 pH 范围内,基因组 DNA 不可逆变性而质粒 DNA 由于有特有的
拓扑超螺旋结构，只发生可逆变性,可以在下一步中和过程中自然复性；SDS 的第二
个作用是溶解蛋白质（平均两个氨基酸上结合一个 SDS 分子）和脂肪。第三步是中
和。中和液的成份是 3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。它一方面中和 NaOH, 使质粒 DNA
复性而基因组 DNA 仍然保持单链状态；另一方面提高体系中的盐浓度，使蛋白质、
基因组 DNA 和 RNA 发生盐析沉淀；此外加入的钾与 SDS 反应生成不溶的十二烷基
硫酸钾（PDS），PDS 还与蛋白质和基因组 DNA 共沉淀。所以中和反应后，大部分
蛋白质、基因组 DNA 和 RNA 都以不溶物状态存在，而大部分的质粒 DNA 由于分子
量较小，不形成任何沉淀，而是以溶液状态存在。第四步是离心。离心过程使第三步
形成的所有不溶物沉淀到管底，上清为质粒 DNA 粗提液，可以直接用于各种质粒精
提方法进行进一步的纯化处理。碱裂解法的最大优点是技术成熟，可以处理从 1mL
到 500mL 或更多的样品，既适合于小规模的科研使用，又能用于工业级大规模生产
临床用的质粒 DNA，并且适用于大肠杆菌的所有菌株。其主要缺点是操作难以控制，
主要原因是使基因组 DNA 发生不可逆变性而环状质粒 DNA 发生可逆变性的 pH 范围
十分狭小（在 12-12.5 之间）。pH 太低或太高都会影响质粒 DNA 的产量或质量。另
一缺点是大规模处理时不容易去除 RNA 污染，尤其是在大规模纯化时，因为使用
RNase 成本很高，同时容易引入动物源性的病原。第三个缺点是步骤多，质粒 DNA
损失多，最终回收率只有 50-70%左右。最近德国 Eppendorf 公司推出了一种基于
溶菌酶裂解细菌的一步式质粒 DNA 纯化产品 FastPlasmid Mini，与雅吉基因的一步
式质粒 DNA 纯化产品相比，操作过程十分相似，最大的不同是雅吉基因的产品不需
要使用动物源性的溶菌酶和 RNase，更适用于工业级大规模质粒 DNA 纯化。其次，
雅吉基因产品使用化学法裂解细菌，效果比 Eppendorf 的基于溶菌酶的温和裂解方
法效果更好，对内源 DNase 的抑制更彻底，能有效防止其对质粒 DNA 的破坏。大肠杆菌BL21 Star(DE3)化学感受态细胞