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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存:
608
- 英文名:
2×GC-rich PCR MasterMix
- 保质期:
长期
- 供应商:
北京百奥莱博科技有限公司
- 保存条件:
-20℃,避免反复冻融
特别声明:本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品,严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。
北京百奥莱博专业生产供应北京2×富含GC PCR MasterMix厂家,我公司销*(代"售")全品类的分子生物学试剂,价格优惠,欢迎广大科研工作者垂询订购。
名称:北京2×富含GC PCR MasterMix厂家
规格:1ml
英文名:2×GC-rich PCR MasterMix
品牌:百奥莱博
产地:国产|进口
编号:WE0116
本品是由Bes Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg2+、dNTPs以及PCR稳定剂和增强剂组成的预混体系,浓度为2×。预配好的PCR混合液使操作更加简单快捷,可最大限度地减少人为误差和污染。经过优化的缓冲液配方使酶的作用发挥最大功效,实现对复杂模板的高保真、高效率扩增,独创的MasterMix配方使整个反应体系非常稳定,重复性好。本品不含染料,PCR程序结束后可根据需要加入适量上样缓冲液后进行电泳操作。扩增得到的PCR产物3"端附有一个“A”碱基,因此可直接用于T/A克隆。主要适用于对保真性要求较高的PCR反应和结构复杂的模板如GC含量高,有二级结构等的扩增,对简单模板有效扩增的片段可达20kb,对复杂模板可达10kb。
产品组成:
| 组份 | 1ml |
| 2×GC-Rich PCR MasterMix | 1ml |
| ddH2O | 1ml |
注意:2×GC-Rich PCR MasterMix含有Bes Taq DNA Polymerase,3 mM MgCl2 和400μM each dNTP。
质量控制:
1、经检验无外源核酸酶活性;
2、PCR方法检测无宿主残余DNA;
3、能有效地扩增多种基因组中的单拷贝基因。
使用方法:
以下举例为以人基因组DNA为模板,扩增1 kb的片段的PCR反应体系和反应条件,实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小不同进行相应的改进和优化。
1、PCR反应体系
| 试剂 | 50μl反应体系 | 终浓度 |
| 2×GC-Rich PCR MasterMix | 25μl | 1× |
| Forward Primer,10μM | 2μl | 0.4μM |
| Reverse Primer,10μM | 2μl | 0.4μM |
| Template DNA | <0.5μg | <0.5μg/50μl |
| ddH2O | up to 50μl |
注意:引物浓度请以终浓度0.1-1.0μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下,可提高引物的浓度;发生非特异性反应时,可降低引物浓度,由此优化反应体系。
2、PCR反应条件
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
| 预变性 | 94℃ | 2 min | |
| 变性 | 94℃ | 30 s | 25-35 个循环 |
| 退火 | 55-65℃ | 30 s | |
| 延伸 | 72℃ | 30 s | |
| 终延伸 | 72℃ | 2 min |
注意:
1)一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃,无法得到理想的扩增效率时,适当降低退火温度;发生非特异性反应时,提高退火温度,由此优化反应条件。
2)延伸时间应根据所扩增片段大小设定,Bes Taq DNA Polymerase的扩增效率为2 kb/min。
3)可根据扩增产物的下游应用设定循环数。如果循环次数太少,扩增量不足;如果循环次数太多,错配机率会增加,非特异性背景严重。所以在保证产物得率的前提下应尽量减少循环次数。
储存条件:-20℃,避免反复冻融。
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北京2×富含GC PCR MasterMix厂家关键词:WE0116,2×富含GC PCR MasterMix,2×GC-rich PCR MasterMix
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文献和实验5 min 结果:可见Bioteke 2×power Taq PCR MasterMix试剂对于原核或真核生物DNA均可高效。相较于同类的taq mix的扩增效率更高,且对于高GC含量也可得到很好的扩增。取扩增产物10 μL用1%琼脂糖凝胶电泳如图可见明亮条带。 三、 cDNA扩增 人类胎盘提取的总RNA反转录的cDNA扩增1.2 kbp片段 模板:人类胎盘提取的总RNA反转录的cDNA 200 ng/50 μL Primer: PrimerF
的稳定性。四、避免引物对3'末端存在互补序列,这会形成引物二聚体,抑制扩增。在用软件设计时大家常常会疑惑,究竟? G 不能低于多少?这里有个数据: ? G 为0~-2时,PCR 产率可达100%, ? G=-6 时,为40%。五、避免3'末端富含GC.设计引物时保证在最后5 个核苷中含有3 个A 或T。六、避免3'末端的错误配对。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。3’最好以G或C 结尾,防止AT 的松散结合引起错配。七、避免存在可能会产生内部二级结构如发夹结构的序列,这会破坏引物退火稳定
章)。如果使用GSP,确保引物的Tm值与预计的保温温度相同。不要在高于60℃时使用oligo(dT)和随机引物。随机引物需要在增加到60℃前在25℃保温10分钟。除了使用较高的逆转录温度外,还可以通过直接将RNA/引物混合物从65℃变性温度转到逆转录保温温度,并加入预热的2×的反应混合物提高特异性(cDNA热启动合成)。这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对。使用PCR仪可以简化RT-PCR所需的多种温度切换。 图6 温度对不同模板的影响 使用
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