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细胞增殖及毒性检测试剂盒(CC
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血清,血浆,组织
人,大小鼠
细胞增殖
上海雅吉生物科技有限公司
48T
CCK-8试剂中含有WST-8(化学名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐)是一种类似于MTT的化合物,它在电子耦合试剂1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)存在条件下,可以被线粒体内的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物Formazan (参考图1),生成的Formazan数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析,细胞增殖越多越快,则颜色越深;细胞毒性越大,则颜色越浅。
图1. WST-8检测原理图 (EC=electron coupling reagent,即电子耦合试剂)
WST-8与以往的增殖/毒性测定试剂相比,具有明显优点(参考表1),广泛应用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验。
表1. 增殖/毒性测定试剂的比较
检测方法
MTT法
XTT法
WST-1法
CCK8法
甲瓒产物的水溶性
差(需加有机溶剂溶解)
好
检测灵敏度
高
很高
最高
检测时间
较长
较短
最短
检测波长
560-600nm
420-480nm
430-490nm
细胞毒性
高,细胞形态完全消失
很低,细胞形态不变
试剂稳定性
一般
较差
很好
批量样品检测
可以
非常适合
便捷程度
便捷
非常便捷
对照实验:采用某国外品牌CCK-8试剂盒作为对照,在相同的实验条件下,检测细胞的活力。 "检测结果:如图2所示,雅吉生物细胞增殖及毒性检测试剂盒(CCK-8)测得的吸光值/细胞数目比值更大,灵敏度更高,与某国外品牌CCK-8试剂盒相比实验差异极小(在5%左右,几乎相当于不同批次之间的差异)。
图2. 使用雅吉生物CCK-8与其他国外品牌CCK-8灵敏度的比较
4℃避光保存,一年有效。-20℃可以储藏更久,但反复冻融会增加背景值,干扰实验测定,因此请将经常使用的试剂保存在4 ℃。 实体组织单细胞 悬液的制备 1.机械法 ①用剪刀剪碎或者用锋利的解剖刀剁碎组织; ②将剪碎的组织加入匀浆器中匀浆; ③用吸管或注射器抽吸细胞悬液,以分散细胞; ④将细胞悬液在尼龙网或不锈钢网上过滤,滤出的细胞悬液细胞计数后即可使用。 2. 酶处理法 此法是实体组织分散为单个细胞的主要方法。由于不同酶对细胞内和细胞间不同组分有特异消化作用,所以应根据所用组织类型确定使用酶的种类。此外,乙二胺四乙酸(EDTA)能结合组织中的二价钙离子和镁离子,而二价钙离子和镁离子有维持细胞表面完整性和维持细胞间质结构的作用,因此,几种酶和EDTA联合使用有助于充分消化实体组织,提高细胞产出效率。下面仅介绍组织消化的一般过程,对于每种组织消化时所用的具体步骤需参考该组织细胞培养时的消化方法。 ①将组织剪成1~2mm3左右的小块。 ②用胰蛋白酶或胶原酶消化组织块,胰蛋白酶适用于消化细胞间质较少的软组织,如胚胎、上皮、肝、肾等组织。胰蛋白酶工作浓度一般为0.1%~0.5%。对于纤维较多的组织或较硬的癌组织常用0.25%胶原酶,胶原酶对组织中胶原蛋白类结构消化作用强,它仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。胶原酶常用剂量为0.1~0.3ug/ml。用大于组织量30~50倍的胰蛋白酶液或胶原酶液在37℃条件下消化组织,需每隔一定时间摇动一次。消化时间的长短依组织类型而定,一般来说,胰蛋白酶需作用20~60分钟,胶原酶需4~48小时。在消化过程中,如发现组织块已分散而失去块的形状,经摇动即可成为絮状悬液,则可取出少量液体在显微镜下观察,可见分散的单个细胞和少量的细胞团,可认为组织已消化充分。 ③消化完毕后,将细胞悬液通过100目孔径尼龙网或不锈钢网滤过,以除掉未充分消化的组织。 ④已过滤的细胞悬液经800~1000rpm低速离心5~10分钟后,弃上清液,加PBS液,轻轻吹打形成细胞悬液,细胞计数后即可使用。
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