线粒体蛋白提取试剂盒

【中文名称】：线粒体蛋白提取试剂盒
【所属类别】：仅供科研
【规格】：50T   20T
【检测方法】：TUNEL方法检测细胞凋亡
【保存方法】：4℃保存6个月；避免反复冻融

定义：磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

线粒体蛋白提取试剂盒操作步骤
（1） 使用前低速离心，以免液体积存管盖和管壁；
（2） 本试剂只适用于实验，不适用于临床检测；
（3） PI（propidium iodide，溴化丙锭）有毒性，能通过皮肤吸收，对眼睛有刺激作用，使用时需戴手套；
（4） Annexin V-FITC 和 PI 是光敏物质，在操作时请注意避光。在处理和标记时，尽可能在暗处进行。在孵育阶段，用铝箔包裹容器或置于抽屉中。细胞标记后，在暗室内用显微镜观察；
（5） 整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞，尽量在 4℃下操作，以免影响细胞状态。
（6） 在细胞洗涤的最后一步，请尽量将上清弃净，以免 PBS 残留，有可能会影响实验结果。
（7） 为防止荧光衰变，宜在 1 小时内进行流式检测。
（8） PI 染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高，建议首先进行Annexin V-FITC 染色，最短可在上机前 5 分钟再加入 PI 染色。

线粒体蛋白提取试剂盒相关产品如下：

G002-2	TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒 （荧光及显色法，石蜡切片）	20T	1800元
		50T	2800元
G002-3	TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒 （荧光及显色法，冰冻切片）	20T	1800元
		50T	2800元
G002-4	TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒 （荧光及显色法，细胞样本）	20T	1800元
		50T	2800元
G003-1	Annexin V-FITC/PI双染 细胞凋亡检测试剂盒	10T	380元
G003-2		20T	600元
G003-3		50T	980元
G004-1	Annexin V-EGFP/PI双染 细胞凋亡检测试剂盒	10T	380元
G004-2		20T	600元
G004-3		50T	980元
G005-1	Annexin V-PE 细胞凋亡检测试剂盒	10T	600元
G005-2		20T	900元
G005-3		50T	1600元
G006	线粒体提取试剂盒	50T	800元
G007	线粒体/细胞核提取试剂盒	50T	800元
G008-1	线粒体蛋白提取试剂盒	50T	980元
G008-2		100T	1680元
G009-1	线粒体膜电位检测试剂盒 （JC-1法）	10T	680元
G009-2		20T	980元
G009-3		50T	1680元

线粒体蛋白提取试剂盒细胞样本的前处理
一、匀浆介质
一般采用0.05 mol/L Tris-HCl, pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS),客户可根据样本及测定指标的情况自行设定浓度,目的是保持样本的等渗环境。
二、细胞样本的前处理:
1、细胞沉淀的收集：
① 悬浮细胞: 对于悬浮培养的细胞，直接通过离心收集细胞沉淀，将培养液在室温条件下1000转/分,离心10分钟，弃上清留细胞沉淀。
② 贴壁细胞: 对于贴壁培养的细胞，用胰酶将细胞消化下来，或用细胞刮将细胞刮下来，将培养液在室温条件下1000转/分,离心10分钟，弃上清留细胞沉淀。
我们一般建议客户，细胞密度最好不要小于一百万个/ml。
2、细胞沉淀的洗涤：
在细胞沉淀中加入0.5-1ml的PBS （等渗）， 轻轻颠倒混匀，将培养液在室温条件下1000转/分,离心10分钟，弃上清留细胞沉淀。
重复上述操作反复洗涤1～2次。
3、匀浆的方式：手工匀浆，超声破碎,裂解液裂解,反复冻融。
① 手工匀浆：在细胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根据所测指标的不同而有所改变，一般加入0.5ml，细胞密度不小于一百万个/ml），混匀，将细胞悬浮于PBS中，用移液器将细胞悬浮液移至玻璃匀浆管中（2ml玻璃匀浆管），将玻璃匀浆管置于冰水混合物中，手动匀浆3分钟，然后取破碎好的细胞悬浮液进行测定。
② 超声破碎:
在细胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根据所测指标的不同而有所改变，一般加入0.5ml，细胞密度不小于一百万个/ml），混匀，将细胞悬浮于PBS中，在冰水浴条件下进行如下操作:
     a、用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用400安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。
      b、用超声细胞破碎仪，300W功率，每次超声3～5秒，间隔30秒，重复4～5次。
③ 裂解液裂解 
常用裂解液有SDS、NP-40、TritonX-100,这三种去垢剂的作用是不同的，或者说作用力量强弱不同。
1、SDS属于离子型去垢剂，最厉害，基本可以把细胞完全破掉，DNA会释放出来，裂解液变得很粘稠。
2、NP-40是很温和的去垢剂，1%浓度的基本可以破坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱，结合特定的buffer可以获得胞浆蛋白。
3、TritonX-100的能力介于NP40和SDS之间，偏向于NP40，也是常用的细胞裂解液成分之一，在保护蛋白活性方面有一定作用（SDS基本会使蛋白变性失活）。
去垢剂属性只是一方面，buffer、配比、浓度、提取方法和材料处理也都是关键因素
由于很多裂解液都是蛋白变性剂,对酶活力的测定有一定的影响,一般不推荐用裂解液进行裂解。
④ 反复冻融:
在细胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根据所测指标的不同而有所改变，一般加入0.5ml，细胞密度不小于一百万个/ml），混匀，将细胞悬浮于PBS中，放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右）。
由于反复冻融对酶活力影响较大,一般不推荐使用