植物线粒体纯化试剂盒B(精提) 细胞及免疫学

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百奥莱博专业生产销*(代"售")植物线粒体纯化试剂盒B(精提) 细胞及免疫学，我公司供应的分子生物学试剂品类齐全，且具有优势价格，欢迎新老客户垂询订购。

名称：植物线粒体纯化试剂盒B(精提) 细胞及免疫学
编号：BTN111208B
规格：5次
英文名：Plant Mitochondria Purification Kit(B)
植物线粒体是重要的植物细胞器，负责ATP的产生。此外植物很多重要的特性(如雄性不育)也跟线粒体相关，是母系遗传研究的重要材料。对植物线粒体进行生化和遗传研究都需要进行线粒体纯化。本产品就是专门用于植物细胞线粒体纯化的试剂盒。

产品特点：
1．即用型试剂盒，用户不需要单独配制各种溶液。
2．提供AB 两种进过优化的操作方法，A法利用常规台式冷冻离心机的差速分离原理进行线粒体粗提，所得线粒体含少量其他细胞器污染，可用于后续的SDS-PAGE，Western，ELSIA和蛋白组分析，也可以用于PCR级别的线粒体DNA和RNA提取。
3．B法利用冷冻超速离心(离心力达40000g)制备的密度梯度来将线粒体粗提液中的线粒体和其他细胞成分进一步分开，得到线粒体精提液，适用于后续的偶联分析、体外线粒体蛋白合成、线粒体成份定位等精细实验。也可用于后续的SDS-PAGE、Western、ELSIA、蛋白组分析和测序级别的线粒体DNA和RNA提取。
4．本产品足够5次提取，每次可处理10g绿色植物组织(可得1-2.5mg左右线粒体)或20g非绿色植物组织(可得2-5mg左右的线粒体)。

试剂盒组成：

 

成分	5T(A型)	5T(B型)
匀浆液	250ml	250ml
洗涤液	250ml	250×2
密度梯度离心介质	无	175ml
BSA干粉	5g	10g
带柄尼龙筛	1只	1只
软毛笔	1只	1只
说明书	1份	1份

储存条件：常温运输和保存，保存期限一年。

使用方法：
注意：线粒体膜对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或者在冷室进行，所用植物组织，器皿和溶液均需要在4℃预冷。任何情况下线粒体的温度都不要超过4℃。

一、选择组织
1．植物组织不同，线粒体产率不同，请以下表为参考：

植物组织种类	线粒体产率	说明
根和块茎	0.3mg/10g	如土豆，红薯等
黄化苗(下胚轴、子叶、胚芽鞘)	2-5mg/10g	多酚含量低于叶片
有光合作用的叶片和子叶	1-2.5mg/10g	需放置在暗处3天

2．一般纯化最好选用用黄化苗。如果用绿色组织(如叶片)，需将植物提前放在暗室至少3 天以降低淀粉含量，否则淀粉颗粒将干扰线粒体的纯化。
3．一次实验需要40mL匀浆液、约90mL洗涤液和35mL梯度离心介质。这些溶液用前均需要加入BSA干粉使其终浓度为0.1%(100mL溶液加0.1g BSA干粉，轻柔颠倒混匀或搅拌溶解后放冰上预冷待用)。每次实验用多少配多少，不要预先将所有BSA干粉加入，否则容易长菌。

二、线粒体粗提(A法)
1．将10 g的绿色植物组织(如去叶脉后的嫩叶子，愈伤组织)或20 g干净的非绿色植物组织(如发芽组织、根、块茎等)浸泡在冰水中10分钟，用纸吸干液体后浸泡在预冷的40mL匀浆液(需先加0.1% BSA)中，在浸泡状态
下剪成1cm2大小的碎片。注意：如果样品可分成多组平行处理，得到线粒体粗提物后再汇集，否则线粒体产率将急剧降低。
2．将匀浆液和其中的植物组织碎片转移到Waring 匀浆器中，中速匀浆3次，每次15秒，每次之间间隔10秒以便让碎片沉淀下来到刀片处。也可使用研磨法。具体操作是将匀浆液和其中的植物组织碎片转移到预冷的研钵中，研磨3-4分钟。注意：植物组织匀浆后释放的物质会使匀浆液酸化，降低pH，而线粒体对pH变化非常敏感，因此建议匀浆后用pH试纸检测匀浆液的pH，如果低于7.0，必须用自备的5 M KOH 将pH调到7.0以上才进入下一步。
3．用带柄尼龙筛过滤匀浆液，穿透液可通过预冷的漏斗收集到预冷的50mL的塑料离心管中。
4．在低速固定角度冷冻离心机上4℃ 1000 g离心5分钟，沉淀为未破碎的细胞、破碎细胞的碎片、细胞核和淀粉颗粒，上清含线粒体。小心转移上清到新的预冷的50mL塑料离心管中。
5．将装上清的离心管在水平冷冻离心机上4℃ 12000 g离心20分钟，弃上清液，所得棕绿色沉淀即为纯化的线粒体粗提物。有时沉淀底部还有白色的淀粉沉淀，属于正常现象。
6．加入10mL预冷的洗涤液(需先加0.1% BSA，下同)中，用软毛笔轻柔重悬线粒体沉淀(如果最地下有白色淀粉沉淀，需要避免重悬之)。不能剧烈震荡，否则线粒体容易破裂。
7．将线粒体重悬液转移到新的50mL离心管中，再加入30mL预冷的洗涤液(终体积为40mL)中，4℃ 1000 g离心5分钟。线粒体将在上清中。
8．将上清转移到新的预冷的50mL离心管中，4℃ 12000 g离心20分钟，沉淀为线粒体。小心弃上清。到此步时，线粒体回收率一般在15-30%。
9．在沉淀中加入2mL预冷的洗涤液。用软毛笔轻柔重悬，得到线粒体粗提液。如果有平行提取，可将最多4 管线粒体沉淀重悬在2mL 洗涤液中。线粒体粗提液中线粒体的回收率一般在45-75%。
10．所得线粒体粗提液含其他细胞器(如类囊体膜，质体，过氧化物酶体，乙*(代"醛")酸循环体,或细菌)污染，但可直接用于PCR级线粒体DNA和RNA的提取、呼吸链功能测定，、蛋白浓度测定和线粒体精提。如果需要长期保存，则可以在线粒体重悬液中加入1/20 体积的自备DMSO，混匀后分成0.5mL/管，然后放-80℃保存。如此保存的线粒体酶活性和膜完整性在几年内都不会发生变化。

三、细胞核DNA的去除(纯化测序级的线粒体DNA 才需要进行此操作。本产品不提供相关试剂，实验步骤仅供参考)
11．预留50μL 线粒体粗提液做对照，在约2mL 剩余的线粒体粗提液中加入40μL 25mM的MgCl2，再加入200ug DNase干粉或溶液(总量为200ug即可)，混匀后冰上放置60分钟降解DNA。取少量样品(如50μL)在PCR仪器中加热到95℃变性10分钟，再取其中的10μL和10μL预留的样品一起进行细胞核基因专一性PCR，如果DNase处理的样品没有扩增，而预留样品有扩增，则表明DNA 去除比较干净(达到PCR 检测的极限)，则进入下一步。如果未去除干净，则继续在冰上放置，直到PCR 检测不到细胞核DNA。
12．加入0.32mL预冷的0.5M的EDTA溶液和40mL预冷的洗涤液。
13．4℃ 1000 g离心5分钟，将上清转移到新的预冷的50mL离心管中，4℃　12000 g离心20分钟，沉淀为去除细胞核DNA的线粒体。重悬在2mL 洗涤液中。

四、线粒体精提(B法，需要40000g的超速冷冻离心机)
14．在50mL预冷的塑料离心管中先后加入35mL预冷的密度梯度离心介质(需先加0.1%BSA)。
15．将2mL 线粒体粗提物重悬液铺在密度梯度离心介质上。
16．在超速水平离心机上4℃ 40000g离心45分钟，最上层为黄色或橙色的质体带(如果材料是绿色植物，此带将是绿色)，其下的白色不透明的带即为线粒体，管底沉淀为过氧化物酶体。其示意图如下：

17．用广口吸管(可将1mL 蓝抢头中间剪断后使用)收集线粒体带，注意避开其上的质体带过氧化物酶体沉淀，估计所取含线粒体溶液的体积。
18．在15-20分钟的时间内缓慢加入至少4倍体积的预冷的洗涤液。
19．转入50mL塑料管离心管中，在冷冻离心机上4℃ 15000g离心20分钟，沉淀为线粒体。
20．将线粒体沉淀用软毛笔小心重悬在至少4倍体积的预冷的洗涤液中，在冷冻离心机上4℃ 15000g离心20分钟，弃上清，沉淀即为洗涤后的线粒体精提物。到此步时，线粒体回收率一般在5-15%。
21．将精提的线粒体重悬在1mL预冷的洗涤液中。重悬的线粒体可以立即使用，在冰上最多可放置5-6小时。如果需要长期保存，则可以在线粒体重悬液中加入1/20 体积的DMSO，混匀后分成0.5mL/管，然后放-80℃保存。如此保存的线粒体酶活性和膜完整性在几年内都不会发生变化。

五、线粒体后续处理(本产品不提供相关试剂，实验步骤仅供参考)
22．DNA提取：离心得线粒体沉淀，再按常规的SDS-蛋白酶K酶解，酚*仿抽提，乙醇-盐沉淀的方法制备线粒体DNA。
23．RNA提取：离心得线粒体沉淀，再按常规的Trizol方法制备线粒体RNA。
24．总蛋白提取：按细菌总蛋白提取方法。
25．线粒体内膜，外膜、基质纯化：需要从本公司定做相关产品。
26．其他功能检测：需咨询本公司技术人员是否可以定做相关试剂。

更多有关植物线粒体纯化试剂盒B(精提) 细胞及免疫学的价格及使用说明等，请联系我们的业务经理王欣女士咨询，我公司还销*(代"售")以下产品：
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·酪蛋白溶液(TBS)
编号：BTN131105A
英文名称：Casein Blocking Solution(TBS)
规格：250mL
即用型酪蛋白(1%)用于封闭非特异性位点。
A型：溶于TBS的Hammarsten级酪蛋白，Kathon防腐剂，pH7.4。
B型：溶于PBS的Hammarsten级酪蛋白，Kathon防腐剂，pH7.4。可用于在使用牛奶封闭背景高时作为替代品使用。

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

·一站式MBP标签蛋白纯化套装
编号：BTN130871
英文名称：One-Stop MBP-Tagged Protein Miniprep Pack
规格：2mL
MBP(麦芽糖结合蛋白，Maltose Binding Protein)标签蛋白大小为40 kDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码。MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。如果蛋白在细菌中表达，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。MBP融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化，结合的融合蛋白可用10mM麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。如果要去除MBP融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。可用MBP抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测MBP标签标记的重组蛋白。由于MBP融合蛋白原核表达载体具有表达效率高，易于纯化等优点。在现代分子克隆中MBP常作为融合蛋白被广泛应用。本产品就是专门用于分离纯化MBP融合蛋白的试剂盒，其原理如下：


产品特点：
1．一站式套装，含所需的直链淀粉和琼脂糖介质、溶液和层析柱，操作非常方便。
2．提供 2mL直链淀粉-琼脂糖介质，其最大载量为10mg MBP蛋白/mL介质。
3．采用麦芽糖温和洗脱，无去污剂和变性剂对蛋白活性的影响。
4．本介质可以反复使用多次。

试剂盒组成：

成分	规格
直链淀粉-琼脂糖介质	2ml
1 M Tris-HCl(pH7.4)	25ml
0.1 M EDTA溶液	25ml
2 M NaCl溶液	50ml
蔗糖	20g
PMSF(10mg/mL)	1ml
0.1mM MgCl2溶液	50ml
0.1 M麦芽糖溶液	25ml
层析柱(6mL)	1支
说明书	1份

储存条件：常温运输和保存，但介质需4℃保存，PMSF需要-20℃保存，有效期一年。

使用方法：
1．将直链淀粉-琼脂糖介质充分混匀后，取适量加入到预放了一片筛板的层析柱中(介质用量需要根据MBP蛋白产量决定，其最大载量为10mg MBP蛋白/mL介质，请根据实验需要取适量的介质加入层析柱中)。
2．用5倍柱体积(柱体积指的是填料介质的体积，下同)自备去离子水洗柱，共3次。
3．用5倍柱体积的新配的结合缓冲液洗柱，进行平衡，使填料介质处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。结合缓冲液的配方如下(以10mL为例)：

成分	用量	在结合缓冲液中的浓度
1M Tris-HCl(pH7.4)	0.2mL	20mM
0.1M EDTA溶液	0.1mL	1mM
2M NaCl溶液	1mL	200mM
自备去离子水	8.7mL	-

4．4℃ 5000g离心10分钟收集20mL表达菌液，弃上清，将细胞沉淀(约100mg)悬于2mL冰冷的现配的细胞洗涤液中，4℃ 5000g离心15分钟收集细胞沉淀后，再次悬于2mL冰冷的细胞洗涤液中。(最好用不加诱导物的菌液做对照样。)细胞洗涤液的配方如下(以10mL为例)：

成分	用量	在细胞洗涤液中的浓度
1M Tris-HCl(pH7.4)	0.1mL	10mM
2M NaCl溶液	0.15mL	30mM
自备去离子水	9.75mL	-

5．制备细胞裂解物：
1)如果所用载体不带MBP信号肽序列(如pMAL-c2)
a)超声破碎细胞，功率30 W，保持细胞低温(0℃)，直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。(超声参数需根据仪器型号自行摸索，但裂解物必须不粘稠，否则会堵塞层析柱。)
b)为使溶液澄清，向上述细胞洗涤液中加入35μl PMSF(10mg/mL)。
c)4℃下13000-15000g离心30分钟，以去除残留细胞和细胞碎片以防堵柱，收集上清样品，留样做 SDS-PAGE电泳对照，其余样品用于纯化MBP融合蛋白，直接进入第6步。
2)如果所用载体带MBP信号肽序列(如pMAL-p2)
a)4℃ 5000g离心15分钟收集细胞，沉淀悬于1mL冰冷的现配的细胞裂解液中。细胞裂解液的配方如下(以10mL为例)：

成分	用量	在细胞裂解液中的浓度
1M Tris-HCl(pH7.4)	0.3mL	30mM
0.1M EDTA溶液	0.01mL	0.1mM
蔗糖	2g	20%(m/V)
自备去离子水	加水到10mL	-

b)加入25μl PMSF(10mg/mL)，室温搅动15分钟，于4℃ 13000-15000g离心10分钟收集细胞。
c)旋动细胞沉淀，加入2mL冰冷的0.1mM MgCl2溶液，4℃搅动10分钟。
d)休克细胞4℃ 13000-15000g离心10分钟，在上清中加入10mM Tris-HCl(pH7.4)(可将1 M Tris-HCl，pH7.4稀释100倍配制而成)至pH为7.4。
e)上清用0.22μm或0.45μm滤膜过滤，滤液用100倍体积的10mM Tris-HCl(pH7.4)(配方如上)4℃透析。
f)收集透析后样品，留样做 SDS-PAGE电泳对照，其余样品用于纯化MBP融合蛋白，直接进入第6步。
6．将样品加到平衡好的直链淀粉-琼脂糖介质中(保证目的蛋白与介质充分接触，以提高目的蛋白的回收率)，收集流出液。
7．用10-15倍柱体积的结合缓冲液(配方见上表)进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
8．使用5-10倍柱体积的现配的麦芽糖洗脱液洗脱结合的融合蛋白，收集洗脱液(即目的蛋白组分)。麦芽糖洗脱液的配方如下(以10mL为例)：

成分	用量	在麦芽糖洗脱液中的浓度
1M Tris-HCl(pH7.4)	0.2mL	20mM
0.1M EDTA溶液	0.1mL	1mM
0.1M麦芽糖溶液	1mL	10mM
自备去离子水	8.7mL	-

9．将纯化得到的样品(包括流出液、洗杂液和洗脱液)以及原始样品使用SDS-PAGE检测纯化效果。
10．填料介质清洗：依次使用3倍柱体积的结合缓冲液和5倍柱体积的去离子水平衡介质，最后再用5倍柱体积的20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的20%的乙醇中，置于4℃保存，防止填料被细菌污染。本介质可重复使用。
蛋白酶切割释放靶蛋白(可选步骤，所用试剂需自备)
11．用适当的蛋白酶切割融合蛋白释放靶蛋白。
1)加入自备的凝血酶、肠激酶或Xa因子(根据融合蛋白中的位点选择)。每毫升介质中加入50单位的溶于1mL PBS溶液的蛋白酶。颠倒离心管数次混匀，室温下振荡2-16小时。
2)4℃以500 g离心5分钟，上清小心转移到新离心管中。
3)用传统的层析方法或SDS-PAGE电泳分离靶蛋白和蛋白酶。


植物线粒体纯化试剂盒B(精提) 细胞及免疫学关键词：精提,BTN111208B,Plant Mitochondria Purification Kit(B),植物线粒体纯化试剂盒B,植物线粒体纯化试剂盒B(精提)

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