北京5´末端同位素标记试剂盒价格

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名称：北京5´末端同位素标记试剂盒价格
英文名：DNA 5´End-Labeling Kit
编号：BTN131036
品牌：百奥莱博
规格：20次
本产品为DNA 5´末端标记系统，利用T4 Polynucleotide Kinase(T4多聚核苷酸激酶)和［γ-32P］ATP 对粘性末端或平末端的DNA或RNA的5´末端进行高效标记反应。原理如下：


产品特点：
1. 使用本试剂盒之前，不需要对 5´末端的磷酸基团进行去磷酸化处理，因为使用的kinase 能使5´末端的磷酸与[γ-32P]ATP的γ-磷酸进行交换。
2. 合成的单链或双寡核苷酸的5´末端游离的OH基团都能通过Kinase反应被标记(或者只是简单的磷酸化)。
3. 提供的两种反应液使交换反应和磷酸化反应都能高效进行，均能得到大于106 cpm/pmol(5´-end)的比活性。

试剂盒组份：

 

成分	规格
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	20μl
5×交换反应缓冲液	100μl
10×磷酸缓冲液	50μl
Control DNA	20μl
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、交换反应
1. 实验前需自备的试剂：7 M 醋酸铵、100%乙醇、70%乙醇等
2.在微量离心管中制备下列反应液：

成分	加入的体积
自备的5´磷酸化DNA片段	14μL(≤5 pmoles的5´末端)
5×交换反应缓冲液	5μL
[γ-32P]ATP	5μL
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL
灭菌的超纯水	补足到25μL

注：5 pmoles的5´末端约等于0.17μg的长100bp的双链DNA。
3. 37℃反应30分钟。
4. 70℃加热5～10分钟使酶失活。
5. 加入10μl的7 M CH3COONH4(pH4.5)。如使用CH3COONa做乙醇沉淀时使其终浓度达300mM。
6. 加入87.5μl(2.5倍)的冷无水乙醇，-20℃放置30～60分钟。
7.离心回收沉淀，用 70%的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。
8. 用适当 Buffer 溶解沉淀。
注：通过第5～8 步操作几乎可以除去大部分未反应的[γ-32P] ATP，如要完全将其除去时，乙醇沉淀后用凝胶过滤等方法精制即可。如需用*酚抽提除去蛋白质时，请在第8 步之后进行。

二、磷酸化反应标记

A. 去磷酸化反应
1. 实验前需自备的试剂：TE 饱和酚/*仿、3 M NaCl 、100%乙醇、70%乙醇、牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)等
2.在微量离心管中制备下列反应液：

成分	加入的体积
自备的DNA片段	133μL(≤10μg)
1M Tris-HCl，pH8.0	15μL
牛小肠碱性磷酸酶(CIAP，10～20U/μL)	2μl
灭菌的超纯水	补足到150μL

3. 50℃反应30分钟。
4. 加入150μl的TE 饱和酚/*仿/异戊醇(25：24：1)，充分混匀。
5.离心，取上层(水层)移到另一个微量离心管中。
6. 重复操作 4～5。
7. 加入7.5μl的3 M NaCl(最终浓度150mM)。
8. 加入375μl(2.5倍量)的冷无水乙醇，-20℃放置30～60分钟。
9.离心回收沉淀，用 1mL 70%的冷乙醇清洗后，沉淀真空干燥。
10. 使用 20μl的TE Buffer 溶解沉淀。

B. 磷酸化反应(前反应)
1.在微量离心管中制备下列反应液：

成分	加入的体积
自备的DNA片段	20.5μL(≤5 pmoles的5´末端)
10×磷酸缓冲液	2.5μL
[γ-32P]ATP	1μL
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL
灭菌的超纯水	补足到25μL

2. 37℃反应30分钟。
3.下面的操作与交换反应的第4-8 步操作相同。

三、合成DNA 寡核苷酸的标记
1.在微量离心管中制备下列反应液：

成分	加入的体积
Oligonucleotide DNA with free 5´-OH(5～10 pmoles)	≤3μL
10×磷酸缓冲液	2.5μL
[γ-32P]ATP	1μL
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL
灭菌的超纯水	补足到25μL

2. 37℃反应30分钟。
3.下面的操作与交换反应的第4-8 步操作相同。

四、合成DNA 寡核苷酸的标记
当掺入水平很低的时候，需要使用本步骤，即通过体积排阻色谱或过滤试剂盒除去未反应的标记。Sephadex G-50 层析柱(需另购)对于去除未掺入的dNTPs效果很好，它还能大幅减少小于20个碱基的DNA 寡核苷酸和小于20bp的双链DNA的量。使用之前需要在70℃加热5～10分钟以使T4 多聚核苷酸激酶失活。Sephadex G-25 层析柱可以用来纯化长度不小于10个碱基的寡核苷酸。

注意事项：
1.缓冲液可在室温融解。融解后立即置于冰中，使用前充分混匀。
2. 5×交换反应缓冲液于-20℃冻结保存时会有白色浑浊出现，但不影响反应效果。
3.酶切得到的DNA片段需经乙醇沉淀等方法纯化。
4. 当用于交换反应的DNA在5 pmoles以上(约1,000bp以上)时，标记效率有时会低于106 cpm/pmol。
5. 如果交换反应所用 DNA低于500bp时，标记效率有时会有所降低。
6. 若不进行放射线标记，仅使用本试剂盒做5´末端磷酸化反应时，反应体系中的［γ-32P］ATP可用5μl的10mM ATP 代替。
7. 磷酸化反应时的［γ-32P］ATP可用［γ-35S］ATP 替代。

使用举例：
按照使用方法中交换反应和合成DNA 寡核苷酸的标记的实验操作，取λ-BstP I，λ-Hpa I，λ-EcoT22 I 各3 pmols，用［γ-32 P］ATP 通过正向磷酸化反应或交换反应标记。各DNA片段的放射自显影结果如下所示：


北京5´末端同位素标记试剂盒价格正在火爆热销，除此之外，为您推荐下别热销产品：

·对*醌固定液
编号：BTN131293
英文名称：p-Benzoquinone Fixative Solution
规格：250mL
本固定液为0.4%对*醌PBS溶液。该固定液对抗原具有较好的保护作用，但是对超微结构的保存有一定的影响，因此，常常与醛类固定剂混合使用。

储存条件：常温运输，4℃保存，有效期半年。

·超敏型BCA法蛋白定量试剂盒
编号：BTN80816
英文名称：Hypersensitive BCA Protein Assay Kit
规格：500次
本产品是在BCA法蛋白定量试剂盒(BTN80815)基础上改进的超敏蛋白定量试剂盒，尤其适合对低浓度的蛋白质溶液进行定量分析。

产品特点：
1．超敏感，最低检测浓度为0.5μg/mL。
2．线性范围在 0.5～20μg/mL，尤其适用于低浓度的样品。
3．对大多数离子型和非离子型去污剂不敏感，但对Cu的还原剂和螯合剂敏感。
4．比 Lowry法更加简单快捷，45分钟内完成测定。
5．试剂稳定，室温可以放置两年，工作液1 天内有效。
6．终产物稳定，检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。
7．最短可以检测双肽，所以适合于分子量较小的蛋白质，而Bradford法需要一定大小的蛋白质。

试剂盒组成：

成分	规格
溶液A	250ml
溶液B	250ml
溶液C	10ml
BSA标准品(2mg/mL)	1ml
说明书	1份

储存条件：常温运输和保存(但BSA 标准品需要低温运输，-20℃保存)，有效期一年。

使用方法：(96板操作模式)
1．将本试剂盒提供的BSA标准品用自备的样品缓冲液稀释成浓度为0.04μg/uL的工作液待用(一次测试所需BSA标准品工作液的用量参见下表)。
2．取一块96孔板，先进行编号(编号可以根据样品数增加)，并按照下表加入BSA工作液、待测样品和样品缓冲液：

编号	BSA工作液 (μL)	待测样品 (μL)	样品缓冲液 (μL)	总体积 (μL)	蛋白含量 (μg)
0	0	0	150	150	0
1	5	0	145	150	0.2
2	10	0	140	150	0.4
3	20	0	130	150	0.8
4	40	0	110	150	1.6
5	60	0	90	150	2.4
6	80	0	70	150	3.2
7	100	0	50	150	4.0
样品1	0	?μl	补到150	150	未知
样品N	0	?μl	补到150	150	未知

3．计算 BCA工作液需要量：根据样品数量(包括制备标准曲线的样品的数量)和每个样品需要0.15mL BCA工作液的比例，计算所需BCA工作液的用量。
4．配制 BCA工作液：先将溶液A、溶液B和溶液C按50：48：2的比例混合，所得溶液即BCA工作液。比如：5mL溶液A + 4.8mL溶液B + 200μL溶液C。
5．将1倍体积(即150μL)的BCA工作液加入到各孔中并混匀。如果用排枪加入并混匀则更好。也可把96孔板放在振荡器上振荡30秒混匀。
6．60℃放置1小时。
7．冷至室温，10分钟内完成后续测定，否则化学反应还在继续进行，光吸收值会慢慢升高，每10分钟会升高2.5%左右。
8．在 562nm下比色测定其余样品的光吸收。如酶标仪没有562nm的设定，可用接近的波长检测，如570nm。
9．将编号为0 号的样品(对照)的读数从其余所有样品(包括0 号样品，其读数变成零)中扣除。
10．以0-7 号样品的BSA含量(μg，见上表最右行)为横坐标，以上一步得到的这几个样品的吸光值为纵坐标，绘出BSA的标准曲线。
11．再将待测样品的吸光值(减去0 号样品的读数后)标在标准曲线上，其在横坐标上对应的蛋白含量(μg)就是待测样品中的蛋白质含量，除以样品稀释液总体积(20μL)，乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度(单位：μg/uL)。

注意事项：
1．加工作液后也可以在室温放置2小时，或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。所以，如果蛋白质浓度较低，可以改在60℃孵育60分钟。
2．待测样品浓度在20～2000 微克/毫升浓度范围内有较好的线性关系。
3．在一定浓度范围内BCA法测定蛋白浓度不受下列化学物质的影响：

名称	在此浓度下不受影响
Ammonium Sulfate	1.5 M
Brij-35	5.0%
CHAPS	5.0%
EDTA	10mM
Hepes	100mM
Glycine，pH2.8	100mM
Guanidine HCl	4.0 M
Tween 20、60、80	5.0%
SDS	5.0%
Sodium Acetate pH5.5	200mM
Sodium Chloride(NaCl)	1.0 M
Sucrose	40%
Sodium Hydroxide(NaOH)	0.1 M
NP-40	5.0%
Triton X-100	5.0%
Urea	3.0 M

4．本方法受样品中螯合剂和还原剂的影响，所以需确保EDTA浓度不高于10mM，二硫苏糖醇不高于1mM，β-巯基乙醇不高于1mM，没有任何 EGTA，否则建议使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒(BTN80815)。
5．本试剂受温度和时间影响较大，故需要准确定时和定温，以保证精确定量。


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