北京现货农杆菌AGL1化学感受态细胞销售

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。

百奥莱博专业生产供应北京现货农杆菌AGL1化学感受态细胞销*(代"售")，我公司销*(代"售")全品类的分子生物学试剂，价格优惠，欢迎广大科研工作者垂询订购。

名称：北京现货农杆菌AGL1化学感受态细胞销*(代"售")
英文名：E.coli AGL1 Chemical Competent Cell
编号：BTN140382
品牌：百奥莱博
产地：国产|进口
 AGL1菌株为C58，RecA型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif和羧苄青霉素抗性基因carb，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的琥珀碱型Ti质粒 pTiBo542DT-DNA，此质粒含有vir基因(vir基因是T-DNA 插入植物基因组必需的元件，pTiBo542DT-DNA质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA 顺利转移)。

 本产品为AGL1 农杆菌化学感受态细胞，适用于水稻、杨树、拟南芥等植物的转基因操作，经pCAMBIA2301质粒检测转化效率高达103cfu/μg。

基因型：C58 RecA(rifr/carbr)Ti pTiBo542DT-DNA Succinamopine。

储存条件：干冰运输、-80℃保存，有效期一年。

自备试剂：质粒DNA、液氮等

使用方法：

转化前准备
1. 冰水浴和37℃水浴。
2.液氮或干冰/乙醇混合物。
3. 将抗性平板在28℃培养箱中平衡至少15分钟。
转化方法
1. 取-80℃保存的农杆菌感受态细胞于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。
2. 无菌条件下，向刚刚融化的感受态细胞悬液中加入需要转化的质粒，每100μL感受态细胞加1μg(体积不大于10μl)质粒DNA，轻柔混匀。冰水浴中静置5分钟。
3. 将离心管置于液氮中速冻5分钟(注：也可以用干冰和无水乙醇混合物替代液氮)。
4. 迅速将离心管置于37℃水浴静置中5分钟，不要晃动水面。然后快速转至冰水浴中静置5分钟。
5. 加入800μl 无抗生素的2×YT或LB液体培养基，28-30℃振荡培养2～3小时。使菌体复苏，表达抗性。
6. 5000rpm离心1分钟收菌，保留100μl左右上清，轻轻吹打重悬菌体，均匀涂布到含有相应抗生素的LB 固体培养基平板上，待平板中的液体完全吸收后，倒置平板，28-30℃培养48-72小时。(注：当平板只含有50μg/mLkan时，28℃培养48小时即可；平板中同时加入50μg/mL kan，20μg/mL rif时，需28℃培养60小时；如果使用的平板含有50μg/mL rif 则需要28℃培养72-90小时)。

除北京现货农杆菌AGL1化学感受态细胞销*(代"售")外，我公司正在打折促销以下产品：

·革兰氏阴性菌DNA提取试剂盒(Southern级)
编号：BTN130950
英文名称：Gram negative bacteria DNA extraction kit(Southern Grade)
规格：10次

·一管式点突变试剂盒
编号：BTN100212
英文名称：One-Tube Mutagenesis Kit
规格：10次
基因的定点突变是重要的分子生物学技术，广泛用于载体构建、基因改造、蛋白质功能研究等领域。但传统的方法需要使用单链DNA 模板，而得到单链DNA 模板又需要先将基因克隆到类似M13 这种载体中，操作过程冗长。为了克服这些缺点，本公司将突变位点设计到一对互补的引物中，用高保真扩增质粒模板，然后用Dpn I 去除原始的甲基化模板，新合成的DNA 通过互补形成带切口的双链质粒，直接用于转化感受态细菌。

产品特点：
1. 直接使用质粒DNA作为模板，免去了制备单链DNA的步骤。
2.基于高保真PCR，对模板DNA 序列没特殊要求，可以用于突变任何序列。同时对模板的需求量很少。
3.一管式，全部在一个优化的缓冲体系中完成，非常简单。
4. 使用Dpn I 去除未突变模板，突变效率高达90%。
5.可用于制备点突变，缺失突变和插入突变。
6. 本产品A型适用于8 kb以下，B型适用于8-15 kb。

试剂盒组成：

 

成分	10T(A型)	10T(B型)
高保真酶A型	10μl	无
高保真酶B型	无	10μl
5×高保真酶Buffer A型	100μl	无
5×高保真酶Buffer B型	无	100μl
dNTP(2.5mM each)	50μl	50μl
Dpn I酶	10μl	10μl
超纯水	1ml	1ml

储存条件：低温运输、-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、引物设计及注意事项
用于特定基因突变的引物必须用户单独设计，请参考如下一些基本原则进行设计。
1. 共需设计两条完全互补的一对引物，它们覆盖要扩增的突变区位点，突变位点最好放在引物的中心。可以先集中设计一条，然后就可得互补的另一条引物。
2.引物的长度通常为25-45个碱基。引物中突变位点任何一侧都必需满足Tm大于45的条件，Tm 计算方式为Tm=4×(GC 碱基数)＋2×(AT 碱基数)。例如引物agtcaggccaattcgAAGcagtcgaattgccaag 就达到此标准，它的突变位点AAG 所放位置使左侧Tm＝46；右侧Tm＝48，均大于45。
3. 尽量把引物的GC含量控制在40％-60％，结尾的1-3个碱基最好是G或C。
4. 尽量使引物不要产生非常稳定的二级结构和引物二聚体。
5. 最好使用经过PAGE 纯化的引物或更高纯度的引物。

二、待突变模板质粒的选择
1. 必需使用从dam＋的大肠杆菌(这类菌中质粒可以被甲基化)中抽提得到的质粒用于基因定点突变，否则Dpn I 不能把没有酶切的质粒DNA 切除，产生大量的假阳性。常用的大部分大肠杆菌都是dam＋的，包括DH5α、JM109等。不能使用JM110和SCS110以及其它dcm-菌种。
2. 待突变质粒和目的基因的GC含量应该在40-55％，没有任何GC含量超过70%、长度在50bp以上的区域。如果质粒GC含量过高，请先把目的基因克隆到其它合适的载体上，再进行基因定点突变反应。如果目的基因GC含量过高，而突变位点不在高GC含量区域，可以先把该基因的不含高GC含量的一个区域克隆出来，进行定点突变，然后再把突变后的片断克隆回原基因中。如果突变位点在高GC 区，则可以使用高GC 专用PCR反应试剂。

三、基因定点突变反应
1.在一个塑料离心管中加入下列成分：

待突变模板质粒	0.1-0.5μg
5×高保真酶Buffer	10μl
引物一(10-20 uM)	1μl
引物二(10-20 uM)	1μl
dNTP Mix(2.5mM each)	4μl
补水到	49μl

2. 加入1μl高保真DNA聚合酶，混匀，如果PCR仪没有热盖则需要加少量石蜡油。放入PCR仪器中按下面参数进行PCR：

步骤	温度	时间	循环数
变性	95℃	1min	1次
PCR	95℃	40s	18次
	60℃	1min
	68℃	1min/Kb
延伸	72℃	10min	1次
保存	4℃	长时间保持

四、Dpn I消化
PCR反应后，直接在PCR反应体系中加入1μL Dpn I内切酶(该酶在甘油保存液中会下沉到管底，故用前需要充分混匀)。DpnI可以酶切双链都被甲基化的模板质粒，也能降解一条链被甲基化的双链质粒。混匀后37℃孵育2小时后样品可以直接用于转化，或者-20℃保存备用。

五、转化、挑克隆鉴定：
每100 微升感受态细菌(转化效率必须在107/μg以上)中可以加入5-10微升经过Dpn I 消化后的突变产物，按照所使用的感受态细菌的操作方法进行操作。如果PCR 使用了石蜡油，在转化时千万别把它带入转化反应，否则会严重影响转化效率。
在涂板前通过离心浓缩的办法，把所有被转化后的细菌全部涂布到含有适当抗生素的平板上培养过夜。通常会得到50个以下的克隆，可按常规方法制备质粒并测序。

六、常见问题：
1.转化后没有克隆或克隆数极少：
(1)感受态细菌效率不够高，请检测一下感受态细胞的效率，确保转化效率在107/μg。
(2)把Dpn I 消化后的产物用常规的乙醇沉淀浓缩，这样就可以把所有的产物全部用于转化。
(3)优化基因定点突变中的PCR参数。可以把最初的95℃变性时间延长为2分钟，循环中95℃变性的时间延长至1分钟，把循环中的68℃的延伸时间改为1.5分钟/kb 至2分钟/kb，退火可以改为60-55℃或65-55℃等的touch down，退火时间也可以适当延长。
(4)引物设计有问题。通过突变反应中的PCR 没有很好地扩增出预期的突变质粒。
2.有克隆，但没有或很难检测到预期的突变克隆：
使用的待突变的模板质粒量过多，导致Dpn I 消化时不完全，可减少质粒用量。
3. 有突变克隆，但突变位点不是预期的位点：
(1)引物设计不佳，退火温度过低，导致引物退火到错误的地方。
(2)引物质量较差，没有经过PAGE 纯化。这样引物中通常会含有比设计的引物要短的特异性较差的引物，容易导致非预期的突变。


北京现货农杆菌AGL1化学感受态细胞销*(代"售")关键词：农杆菌AGL1化学感受态细胞,E.coli AGL1 Chemical Competent Cell,BTN140382


·亮抑蛋白酶胎溶液(10mg/mL)
编号：BTN100836
英文名称：Leupeptin Solution
规格：1mL
本产品是浓度为10mg/mL水溶液。工作浓度为0.5mg/mL。其作用是抑制丝*酸和巯基蛋白酶，如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、组织蛋白酶B、血纤维蛋白溶酶、激肽释放酶等。亮抑蛋白酶肽是由玫瑰链霉菌Streptomyces roseus MB-26-AI产生的胰蛋白酶抑制剂，它是许多蛋白酶抑制剂中的一种，它的抑制作用与底物呈竞争性抑制。对血纤维蛋白溶酶的抑制IC50(半抑制浓度)为8μg/mL，但不抑制糜蛋白酶。

储存条件：低温运输，4℃保存一周，-20℃保存6个月。

·一管式反转录试剂盒
编号：BTN170403
英文名称：One-tube RT Kit
规格：10次
本产品是一管式反转录预混Mix，内含反转录第一链合成所需的所有试剂(MMLV、Random primers、Oligo dT Primer、dNTP Mixture、反应Buffer等)，用户只需加入模板 RNA和RNase-Free 水即可进行反应。

产品特点：
1. cDNA的合成更加方便，用户只需准备模板和水即可进行反应。
2.快捷，操作步骤已经最大限度地简化，能减少污染，降低实验误差。
3. 效率高，特殊优化的oligo dT和N6 随机引物配比，反转录效率高。
4. 速度快，只需42℃，20分钟即可完成cDNA 第一链的合成。
5. 能够用于GC含量高，二级结构复杂的RNA 模板，合成cDNA片段长度可达12kb。
6. 兼容性好，合成的cDNA可直接用于荧光定量PCR反应，灵敏度高、稳定性好。

试剂盒组成：

成分	规格
2×RT MasterMix	0.1ml
RNase-Free 水	1ml
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：
1. 解冻后颠倒轻弹混匀各组分，以20μL 体系为例，按下表加入(2×RT Master Mix很粘稠，取用前请短暂离心，并避免吸头外壁沾附损失)：
2×RT MasterMix

10μl
Total RNA/mRNA 模板(自备)	50ng-2μg/5-200ng
补RNase-Free 水到	20μl

 注意：对于二级结构很复杂的RNA 模板，推荐使用变性步骤，即在操作步骤之前，将模板RNA在65℃孵育5分钟后迅速转移到冰上，再进行下一步操作。
2. 轻轻混匀，42℃孵育20分钟进行反转录反应。
 注意：对亍二级结构复杂或者GC含量高的模板，可以提高温度至50℃，以增强反转录效率。
3. 85℃加热5秒钟灭活反转录酶置冰上备用(更长时间保存请置于-20℃)。

注意事项：
1. 实验过程中请注意避免RNase污染，防止RNA降解或实验中的交叉污染。
2. 使用之前请完全溶解并充分混匀，以防因盐离子浓度丌均影响实验结果。
3. 使用后应尽快放回-20℃，避免反复冻融。
4. RNA模板的完整性对cDNA合成效率起着决定性作用，因此请选择可靠的RNA提取/纯化方法。
5. 如果扩增片段较长或者RNA结构复杂，为了加强转录效果，可以将RNA单独置于65-70℃加热5-10分钟后再加入体系。
6. 操作人员请带口罩和一次性手套，并经常更换手套。


北京现货农杆菌AGL1化学感受态细胞销*(代"售")关键词：农杆菌AGL1化学感受态细胞,E.coli AGL1 Chemical Competent Cell,BTN140382

N-乙酰-L-异亮*酸 DL-5-HTP 3077-46-1
癸基吡喃葡萄糖苷 L-Alanine 58846-77-8
PY02-366  *基酸脱羧酶试验培养基  20支  
9001-59-6 Pyruvic kinase 丙*(代"酮")酸激酶
50-76-*(代"0") 放线菌*(代"素")D Actinomycin D
非诺贝特 Fmoc-D-Met-OH 49562-28-9
F030622 FITC标记兔抗人IgG FC抗体 Rabbit Anti-Human IgG(FC)*FITC
F030422 胶体金标记兔抗人IgG FC抗体 Rabbit Anti-Human IgG(FC)*GOLD
ARB10238 人ω干扰素(IFN-ω)酶标法分析 Human interferon ω,ifn-ω ELISA KIT
ARB12392 大鼠单核细胞趋化蛋白1(MCP-1/CCL2/MCAF)含量测试 Rat monocyte chemotactic protein 1/monocyte chemotactic and activating factor,mcp-1/mcaf ELISA KIT
ARB13273 小鼠碳酸酐酶(CA)含量检测 Mouse carbonic anhydrase,ca ELISA KIT
PY02-277  MUGal肉汤基础  100克  
58-63-9 Inosine，Free Base 肌苷
丫啶黄素 Potassium gluconate 8048-52-0
BL0287 M199/EBSS
1-亚硝基-2-*酚 AMEO 131-91-9

北京百莱博科技有限公司专业生产克隆与表达产品，欢迎来电咨询选购北京现货农杆菌AGL1化学感受态细胞销*(代"售")。