pUCm-T载体优惠

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百奥莱博专业生产供应pUCm-T载体优惠，我公司销*(代"售")全品类的分子生物学试剂，价格优惠，欢迎广大科研工作者垂询订购。

名称：pUCm-T载体优惠
英文名：pUCm-T vector
品牌：百奥莱博
规格：1μg
产地：国产|进口
本产品是一种高效克隆PCR产物(TA Cloning)的专用载体。本载体由pUC系列载体改造而成，在pUC载体的多克隆位点处插入特殊的限制性内切酶识别位点，酶切后能在载体的3´端形成悬挂的“T”末端。很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA 每条链的3´端加上一个突出的碱基A。这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT 配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到，pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。可以通过蓝白斑筛选有插入片断的重组克隆，大大提高了3´末端A 突出PCR产物的连接、克隆效率。本产品应用于进行TA 克隆，克隆PCR产物。对克隆后的PCR产物可以用M13通用引物进行DNA 测序。

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一. 实验准备
1. PCR产物3´末端带有突出的A碱基：Taq、Tth、Ampli Taq、Klen Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物3´末端均带有突出的A碱基。建议扩增的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行回收，再进行连接转化实验。
2. PCR产物3´末端没有突出的A碱基：Pfu、Pwo、Tli或DeepVent等DNA聚合酶具有3´5´外切酶活性，其扩增的PCR产物末端可能不带有3´A，要对这种平末端PCR产物进行克隆，应先对其进行3´末端加A，再进行连接转化实验。

二.连接反应
3.在一个标准的10mL连接反应体系中，加入下列成分：

 

反应组分	10μl反应体系
插入的目的片段	xμL(0.2 pmol)
本产品	1μL(50 ng)
10×连接酶缓冲液	1μL
T4 DNA连接酶	3-5 U
补水到	10 L

 注意:一般最后加入T4 DNA连接酶。
4. 用移液器吹打反应混合液使之混匀后，16-23℃连接1～12小时(或按T4 DNA连接酶供货商提供的操作手册进行连接)。

三．细菌转化和鉴定
5. 将100μl感受态细胞置于冰上解冻后，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮。
6. 加入上述5μl连接液，轻轻混匀，冰上放置30分钟。
7. 42℃水浴热激90秒，再冰上放置15～20分钟。
8. 加入400μl自备的SOC培养基，37℃ 200～250rpm振荡培养1小时。
9. 4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400μl上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮。
10. 将细菌悬液均匀涂布在含20μl的IPTG(100mM)和100μl的X-gal(20mg/mL)的*苄青霉素抗性的自备的LB平板上。(涂布菌液的用量可以根据连接的效率及感受态细胞的转化效率而进行适当的调整。)
11. 将平板于37℃培养1小时，然后倒置培养过夜。(先将平板正向放置1小时，以吸收过多的液体。)

四．筛选
12.转化子的蓝白筛选：
 当外源DNA片段插入到pUCm-T载体中后，由于外源DNA的核酸序列存在改变了LacZ基因的编码，从而影响了其产物β-半乳糖苷酶α-片段的活性，因此重组克隆在-gal/IPTG 平板上呈现为白色，而非重组克隆呈蓝色。选择在IPTG/X-gal 平板上生长的白色菌落，用牙签挑至含*苄青霉素的液体培养基，37℃培养过夜。
13.转化子的鉴定：
1)用上述培养的白色菌落的菌液抽提质粒，用PstI单酶切或用其它合适的酶切,琼脂糖凝胶电泳检查片段大小，确定是否含有目的片段。
2)用M13通用引物或其它合适的引物直接进行测序来确定是否含有目的克隆。

操作提示：
1. PCR产物的纯度：
 连接反应前需用琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物，如果电泳检测PCR产物条带弥散，或出现非特异条带，则需要切下目的条带，用胶回收试剂盒对目的片段进行回收。若PCR产物电泳检测只有预期大小的明显条带，也应使用PCR产物纯化试剂盒直接纯化PCR产物，以除去引物二聚体。不经纯化的PCR产物在某些条件下可直接用于连接，但由于引物二聚体和PCR产物中其它物质的影响，造成含有插入片段的阳性克隆数减少，因而需要筛选很多克隆方可得到含有目的PCR产物的阳性克隆。
2. 平端PCR产物
 具有校正活性的热稳定性DNA聚合酶如Pfu、Pwo、Tli在进行PCR扩增时产生平端PCR产物。这种平端PCR产物可以进行3´末端加A 尾后连接到pUCm-T载体中，采用这种方法进行连接，可大大提高克隆的效率。
3.优化插入片段和载体的摩尔比
1)pUCm-T载体优化的插入DNA片段和载体的摩尔比为3:1，采用3-10:1的连接比例也可成功进行连接。如果你的PCR产物开始连接的不理想，则有必要优化连接比例。
2)PCR产物的量可采用以下公式进行换算：
PCR片段的量(ng)= [加入载体的量(ng)×插入片段大小(kb)/载体大小(kb)]×插入片段和载体的摩尔比
4.筛选含插入片段的转化子
插入片段成功克隆到pUCm-T载体中，可阻断β-半乳糖苷酶的编码序列，因而重组克隆可在指示培养基上通过颜色进行筛选。大多数情况下含有PCR产物的克隆菌为白色，如果PCR片段和LacZ基因在同一读码框内，即PCR片段碱基数是3的整数倍(含3´-A)，并且读码框无终止密码子，则重组克隆菌可能为蓝色。

质粒图谱：


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·昆虫RNA柱式提取试剂盒
编号：BTN81220
英文名称：Insect RNA column Extraction Kit
规格：50次
本试剂盒是专门用于从富含多糖、糖蛋白、粘蛋白的动物样品(尤其是昆虫样品)中提取总RNA的试剂。

试剂盒特点：
1. 操作简单快速，处理一个样品只需要约十分钟。
2. RNA纯度高，平均 OD260/280一般都在2.0左右，能够有效去除大多数昆虫中的多糖污染。
3.适用于各种昆虫组织，每100mg组织能提取到20-30μg 总RNA。
4. 得到的RNA可直接用于RT-PCR、Northern杂交、cDNA合成等实验。
5.一站式，提供RNase-free的样品收集管。

试剂盒组成：

成分	规格
溶液A	50ml
溶液B	15ml
溶液C	50ml
离心吸附柱	50套
通用洗柱液	50ml
RNA洗脱液	10ml
说明书	1份

储存条件：常温运输，4℃保存(RNA洗脱液最好4℃保存)，有效期一年。

使用方法：
1. 将50-300mg昆虫组织放入10-15mL塑料离心管中，加入1mL溶液A，然后用匀浆器匀浆5-20秒。匀浆时会产生泡沫，但不影响提取效果。也可以使用液氮砚磨法破碎昆虫组织，砚磨完后加入1mL溶液A。
注意：溶解溶液A沉淀。溶液A在4℃放置后可能会产生沉淀，使用前必须放在65℃水浴使沉淀彻底溶解并充分摇匀后再取用。
2. 将匀浆物或砚磨物转移至干净的1.5mL塑料离心管中(可以不必转移非液体的细胞碎片)。
3.在离心管中加入0.3mL的溶液B和0.2mL自备*仿，在振荡器上振荡30秒混匀，此时溶液呈均匀的乳浊状。振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。
4.室温12000 rmp离心3～5分钟，两相间将有约5-10毫米厚的细胞破碎物。
5. 将上清液(约0.6mL)转移到另一干净的1.5mL塑料离心管中，下层有机相和中间层含有DNA、蛋白质和其他杂质，避免触及或吸取。最好留下100μl上清液不取。
6. 加入等体积的溶液C，充分颠倒混匀。
7. 将一半的溶液转移到离心吸附柱中，12000 rmp室温离心半分钟，弃穿透液。
8. 将剩下的一半溶液转移到同一离心吸附柱中，12000 rmp室温离心半分钟，弃穿透液。
9. 加0.7mL通用洗柱液，室温12000 rmp离心半分钟，弃穿透液。
10. 加0.3mL通用洗柱液，室温12000 rmp离心半分钟，弃穿透液。此步可以省略。
11.室温12000 rmp离心半分钟。此步十分重要，否则残留的乙醇会影响RNA的使用。
12. 将离心吸附柱转移到RNase-free收集管中，加入50-100μl RNA洗脱液，室温放置1-2分钟。
13. 12000 rmp室温离心半分钟，离心管中溶液即为RNA样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。
14. RNA完整性的电泳检测：如果需要做Northern杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行RNA电泳，因为非变性胶不能分离所有的RNA分子(BioTechniques，28：414，2000)。注意：大部分昆虫的28S RNA被切割成两个小的片段，彼此用*键相连，所以在甲醛变性胶中，没有28S带出现(文献见：Eva C. Winne*(代"b")eck，Craig D. Millar and Guy R. Warman，Why does insect RNA look degraded? Journal of Insect Science: Vol. 10：1-7)
15. RNA产量产率测定：将5-10μl RNA溶于TE缓冲液中(pH7.5-8.2之间)检测其在OD260的光吸收。通过光吸收可以得出RNA浓度(1 OD260的RNA=40μg/mL)，进而计算出RNA的产量(浓度X体积)和产率(RNA产量/组织用量)。
16. RNA纯度测定：无污染的总RNA的OD260/OD280一般在1.8-2.1之间(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质污染，但一般不影响RT-PCR等反应。

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