TA快速连接试剂盒(pUC-T)厂家

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北京百奥莱博科技有限公司专业生产供应TA快速连接试剂盒(pUC-T)厂家，产品信息：

类别：克隆与表达

英文名：pUC-T TA Cloning Kit

产品名	产品编号	包装规格
TA快速连接试剂盒(pUC-T)	WE0249	20次

规格：20次

产地：国产|进口

编号：WE0249

英文名：pUC-T TA Cloning Kit

品牌：百奥莱博

  pUC-T TA载体是一种高效克隆PCR产物的专用载体，它是由pUC18载体在EcoR V酶切位点处切开，在两侧的3"端添加T而成。由于大部分耐热聚合酶反应时都会在PCR产物的3"端添加一个A，它可以与pUC-T 3"端的T互补连接，因此可大大提高PCR产物的连接和克隆效率。

  试剂盒中配备高效率的T4 DNA Ligase和为快速高效DNA连接优化的2×Quick Ligation Reaction Buffer。连接效率相当于用T4 DNA Ligase 进行常规连接1小时。带有插入片段的重组子可根据α互补原理，进行蓝白斑筛选，判断载体中有无外源基因的插入。克隆后可以用BcaBEST Sequencing Primers和 M13通用引物对PCR产物进行测序。

 

试剂盒组成：

 

组份	20次
pUC-T(50ng/μl)	20μl
Control Insert(50ng/μl)	10μl
Quick T4 DNA Ligase	20μl
2×Quick Ligation Reaction Buffer	120μl

 

注意事项：

 

1、Insert DNA 要求

1)连接使用的PCR片段3’末端应带有“A”尾。有些高保真DNA聚合酶，如我公司的Pfu扩增的PCR产物是平滑末端，可使用加A试剂盒加上A尾后，再进行T载体克隆。

2)PCR产物建议进行切胶回收纯化后再进行T载体克隆，以免PCR产物中的非特异片段或残存引物等杂质影响。推荐使用WE0168快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。

 

2、连接反应要求

1)本试剂盒能使大多数连接反应在25℃条件下5分钟甚至更短时间内达到反应终点，增加反应时间反应效率不会增强。如用快速连接反应1小时后，转化效率会明显降低；如25℃快速连接反应过夜，则转化效率会下降到75%。

2)2×Quick Ligation Reaction Buffer含有ATP，使用前置于冰上使其融化后充分混匀，建议初次使用分装成小管冻存，避免其反复冻融影响DNA连接效率。

3)由于T4 DNA Ligase中含有甘油，比较粘稠容易挂壁，建议使用之前短暂离心将液体收集到管底，取样时枪头尽量不要深入液面太深，以免粘在枪头上造成损失。

4)如快速连接产物用于电转，因快速连接反应体系中的PEG会影响电转效率，建议使用离心柱将连接产物进行DNA纯化(如WE0170快速DNA产物纯化试剂盒)后再进行电转。

 

3、感受态细胞要求

建议使用高效的热击转化感受态细胞，这样才可能得到比较理想的阳性克隆，如需进行蓝白筛选，宿主细胞必须具有正确的基因型(F´编码的【lacZ ΔM15】)产生ω片段，才能与载体DNA产生的LacZ α 多肽结合，表现出β-半乳糖苷酶活性(α互补)。pUC-T TA载体以pUC18载体为基础构建而成，因此，适合pUC18载体的感受态细胞都可以使用。推荐使用本公司WE0251 TOP10感受态细胞、WE0252 DH5α感受态细胞。

 

4、阳性克隆筛选

阳性DNA片段成功插入至pUC-T Vector中后，一般情况下β-半乳糖苷酶的表达将受到破坏，重组克隆体在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB固体培养基上培养时将显示白色菌落。但有时比较短的DNA片段插入载体时，基因的读码框有可能正好与LacZ的读码框相吻合，克隆体也会显示蓝色菌落。

 

5、阳性对照

为了确认实验操作的正确性，以及实验试剂的有效性，我们建议使用本试剂盒中配备的Control Insert(750 bp)进行阳性对照实验。

 

使用方法：

 

1、按以下体系配制反应液：

 

成分	反应体系	对照体系
pUC-T	1μl	1μl
DNA 插入片段	0.1 -0.3 pmol	--
Control Insert DNA	--	1μl
2×Quick Ligation Reaction Buffer	5μl	5μl
Quick T4 DNA Ligase	1μl	1μl
RNase -Free Water	补足至10μl	补足至10μl

注：Insert DNA的使用量：在进行克隆时，Vector DNA和 Insert DNA的摩尔比一般为：1:2-1:10，可根据实验情况选择适当的Vector DNA和 Insert DNA的摩尔数比。Insert DNA的使用量=nmol数×660×Insert DNA bp数。本载体1μl(50ng)的摩尔数约为0.03 pmol。

 

2、轻轻混合，短暂离心。25℃反应5分钟。

注意：反应时间不要超过15分钟，否则会降低连接效率。

3、反应结束后，将DNA连接产物存放于0-4℃，而后进行转化实验；也可将DNA连接产物置于-20℃保存。

注意：勿进行加热失活反应。

4、将连接产物加入50μl感受态细胞中(将感受态细胞置于冰上融化)，冰浴30分钟。

注意：用化学法转化时，连接产物的加入量不要超过感受态细胞体积的10%。

5、42℃热击45秒钟，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。

6、加入450μl无菌SOC或LB培养基，混匀后置于37℃摇床，150 rpm振荡培养45分钟，使菌体复苏。

7、根据实验要求，取适量已转化的感受态细胞，加到含有X-Gal、IPTG和Amp的LB固体培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃，直至液体被吸收后，倒置培养，37℃培养12-16小时。

8、计算白、蓝色菌落，挑选白色菌落，使用PCR法或酶切法鉴定插入片段是否正确。

 

 

储存条件：-20℃。

TA快速连接试剂盒(pUC-T)厂家专业优质供应商：北京百奥莱博科技有限公司

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编号	类别	名称
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WE0359	FITC标记抗体	FITC标记兔抗人IgG(H+L)
WE0289	蛋白质研究	SDS-PAGE上样缓冲液(非还原，5×)
WE0400	DNA纯化	口腔拭子DNA样本保存管
WE0256	蛋白质研究	蛋白*(代"磷")酸酶抑制剂混合物
WE0176	DNA纯化	血液基因组DNA提取试剂盒
WE0371	生物素化抗体	生物素化驴抗人IgG(H+L)
WE0247	克隆与表达	TA快速连接试剂盒(pUC-T Simple)(含载体，连接酶)
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WE0370	HRP标记抗体	HRP标记驴抗鸡IgY(IgG)(H+L)
WE0175	DNA纯化	柱式小量血液基因组DNA提取试剂盒(0.1～20ml)
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WE0238	工具酶	T4 DNA聚合酶
WE0369	二抗	RRX标记驴抗大鼠IgG(H+L)
WE0123	核酸扩增(PCR)	高效热启动DNA聚合酶

 

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