qPCR实验技术/CRO整体实验外包

Q-PCR实验流程：

一、 ①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA 抽提需带口罩。③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管/枪头后，袋子及时封好。④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操 作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口 罩不要在超净台前讲话。

 

二、 总RNA抽提

1)细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol (invitrogen)溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min;

如使用组织样品，则先用液氮充分研磨组织样品，然后加入1ml Trizol (Invitrogen)溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解;(管盖与管壁都需标记样品名称)

2)加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min;(离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致)

3) 4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管;(用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层)

4)沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀(颠倒6-8次)(不应用振荡器混匀)，室温静置10min;

5)4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀(如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀)，去上清;

6)用75%乙醇洗涤两次(12,000g离心5min)(加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀)，超净台风干;沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。

7)视沉淀量加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。

 

三、去基因组

使用RNase-free的DNase І(Promega)，按以下体系配置反应液，37℃消化30min，65℃灭活10min。

RNA  DNase І  10 x buffer  H2O(RNase free) RNasin	30 20 10 39.5 0.5	µl µl µl µl µl
总体积	100	µl

然后按以下步骤操作：

1) 加入等体积的苯酚/氯仿，上下颠倒混匀，室温放置5min后， 14,000rpm离心15min，取上清。

2) 加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀，静置分层后14,000rpm，离心15min，取上清。

3)加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀(颠倒6-8次)，-20℃静置15min;

4)4℃下，14,000g离心15min，收集RNA沉淀，去上清;

5)用75%乙醇洗涤两次(12,000g离心5min)，超净台风干;

6)加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。

 

四、总RNA纯度和完整性检测

1)纯度检测：取1μl RNA样品50倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。

2)总RNA完整性检测：取RNA样品1μl，1%琼脂糖凝胶电泳80V×20min，EB染色10min，用凝胶成像系统观察并拍照，总RNA的5s rRNA， 18s rRNA和28s rRNA条带，三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。

 

五、逆转录

1、mRNA：

1) 在RNase free的PCR管中配置下列溶液：

 

Total RNA  H2O	1.0	µg µl
总体积	12	µl

2) 将上述溶液吹打均匀，置85℃保温5min，使RNA变性。随后立即冰上致冷， 以防止RNA复性；

3) 在该PCR管中加入下列试剂(Promega)

oligo（dT） Random primer  10mM dNTP  RNase inhibitor  5 x buffer  M-MLV	0.5 0.5 2.0 0.5 4.0 0.5	µl µl µl µl µl µl
总体积	8.0	µl

4) 将上述20μl反应溶液30℃保温10min；

5) 42℃保温50min；

6) 85℃保温10min；

7) -20℃保存。

2、microRNA：

使用茎环逆转录法，原理如下图：

1) 在去RNase的PCR管中配置以下溶液；

 

total RNA X个miR逆转录引物 H2O	1.0 0.5*X	µg µl
总体积	12.5	µl

2)将上述溶液混匀，85℃孵育5min，以打开RNA二级结构。随后立即置于冰上，以防止RNA复性再次恢复二级结构；

3) 在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液：

10mM dNTP (promega)  RNase inhibitor (promega) U6逆转录引物 5x buffer  M-MLV (promega)	2.0 0.5 0.5 4.0 0.5	µl µl µl µl µl
总体积	7.5	µl

4) 将3)溶液加入到1)溶液中，混匀后30℃保温10min；

5) 42℃孵育50min；

6) 85℃孵育10min灭活逆转录酶。

 

六、定量PCR检测

1、引物测试：

根据mRNA设计的引物正式实验前需进行qPCR测试其特异性和扩增效率，具体反应体系和反应条件如正式实验，每对引物需做模板水对照。

得到结果后，首先根据熔解曲线判断引物特异性，选择标准为：单峰且峰形偏窄、水对照无明显引物二聚体熔解曲线峰。若设计的多对引物熔解曲线均显示特异性良好，则应对比各引物的扩增曲线，优先选择Ct值小、扩增效率高的引物进行正式实验。

2、确定上机内容后，首先在记录本上编排好上机的样品排放顺序。

(1)一个样品的加样尽可能安排在同一行；

(2)如正式实验中三次重复不能安排在同一板上，则需把三次重复中的实验分开，但同一次重复的实验不能分开两板。

3、正式实验：

体系配制：

H2O 4ul

SYBR Green PCR Master Mix 10ul (TOYOBO)(使用前需振荡均匀)

上游引物 0.5ul (10uM)

下游引物 0.5ul (10uM)

总体积 15ul

计算好实验中需用多少份体系，则按具体量配置。体系分装会有损失，一般多配0.5份--1份体系。

总的体系配好后，在振荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀，然后15ul每管分装至8连管中。

4、cDNA用灭菌纯水稀释适当的浓度，一般为1:20稀释，如遇到基因表达低的样品，则适当降低稀释比例至1:10或1:5。cDNA按一定顺序排好 后，即可加至刚配好的反应体系中。加样完毕，盖好八连管盖，并在八连管盖最上沿的边上标记好1-12的顺序(不可将标记写在反应管的盖子上，八连管盖避免 裸手触摸中间透明的荧光采集区域，且保证每孔均盖紧，否则影响重复性或可能出现熔解曲线峰漂移。)

5、把各排八连管放在掌上离心机上离心数秒。

 

七、上机：

7.1  先开电脑，进入Windows 界面。接着打开PCR仪电源开关。

7.2  打开7500软件，选择“新建”，在“Template”下拉菜单中选择“60”或“65”(普通基因检测为“60”，MicroRNA检测为“65”)。

7.3  打开样品架，放入八连管，关上样品架，并在软件上选择已放反应管的孔位，剔除无反应管的孔位。

7.4  点击File菜单中Save，输入要保存结果的文件名，命名为日期-上机时间-客户名字简写，如100830-1008-WL表示8月30日10点08分魏立的实验。

7.5  点击Start键，开始运行程序。

7.6  程序运行完毕后，取出样品架上的八连管，按顺序关闭ABI PRISM 7500 SDS 软件、PCR仪电源开关。

7.7  在7500软件上标记好每个反应孔的样品名称及检测基因的名称，分类保存好结果文件。

反应完成后，八连管应装到封口袋中，袋子上标记好文件名，客户的名字。(同一个客户的三次重复实验，则只需保存其中一次重复的反应管即可，其余可丢弃)

赛百慷（上海）生物技术股份有限公司主要产品和技术服务：

一、原代细胞服务
       各类模式哺乳动物的多种原代细胞资源；
       多种人源性正常及肿瘤原代细胞资源；
       原代细胞分离和培养相关试剂、kit、培养基添加剂等；
       原代细胞相关技术服务和整体实验外包服务；

二、细胞株/系服务
       细胞株/系培养、增殖、冻存和相关说明书；
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       细胞系培养基、添加剂、血清及相关生长因子、试剂等；

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       iPS细胞基础培养（有滋养层or无滋养层在）；
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赛百慷( 上海 )生物技术股份有限公司( iCell Bioscience Inc，Shanghai )是一家专注于研发生产高品质原代细胞、细胞系、干细胞以及相关生物学试剂，并提供专业生物医学技术服务外包的高新技术企业，公司总部位于上海。

iCell专注于研发生产高品质的人体组织源及动物组织源的原代细胞、细胞系、iPS细胞等产品，提供以及相关的CRO，CMO服务，同时也为客户提供相关培养体系，培养基等试剂。在中国，iCell除与中国科学院细胞库合作外，还与各地医学学院、机构、药企合作，其中包括:上海交通大学医学院，复旦大学医学院。

目前，赛百慷已经建立起国内先进完备的“人类组织源原代细胞库和细胞系库”两大细胞资源库，各种种属源细胞株(系)500多种，原代细胞包括人源、鼠源、兔源、猪源、羊源以及其它动物源近700多种，3000多株现货，引进了生命科学领域的全套实验设备，建立了先进的生产研发实验室，采用了国际先进的行业技术标准、制造工艺、质检流程，保证了产品出厂的品质，公司同时更注重产品售前与售后的技术服务，着重满足客户的需求与体验。还申请了相关细胞培养试剂等十几项专利产品。正是凭借独有的原代细胞领域原创技术的优势，赛百慷（上海）生物技术股份有限公司，已经成为国内外众多生物医药企业诚信的合作伙伴和坚强的技术后盾。

赛百慷公司已及iCell赛百慷人秉承着将细胞培养产业化的良好愿望，多年来一直致力于科研诚信服务，每一株细胞都饱含着赛百慷对于科研严谨的极度追求。