- ¥833
- 康朗生物
- 大陆/美国
- KL209-01
- 2025年07月14日
企业认证
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。内毒素清除剂常温运输，4度可以保存一个月，长期保存放-20℃。
- 保质期：
本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。内毒素清除剂常温运输，4度可以保存一个月，长期保存放-20℃。
- 英文名：
StarPure Endo-free Plasmid Maxiprep Spin Kit
- 库存：
大量
- 供应商：
上海康朗生物科技有限公司
- 规格：
ml/盒
StarPure无内毒素质粒大提试剂盒可最大限度地去除质粒DNA样品中的内毒素，以保证对不同的细胞系都能获得稳定的转染效果。本产品采用改良的碱裂解－中和法，结合硅胶膜吸附技术和内毒素清除剂，使质粒DNA获得高效、专一的吸附，再通过去蛋白液和漂洗液去除基因组DNA、蛋白等其他杂质，最后通过低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净的质粒DNA从硅基质膜上洗脱下来。该方法提取的质粒DNA无基因组DNA、RNA、蛋白质污染，内毒素清除率在90%以上；通常每50~100 ml过夜培养的菌液中可提取出300~500 μg左右的高纯度高拷贝质粒DNA，可直接用于转染真核细胞、荧光测序、酶切、PCR、转化、体外转录等各种常规分子生物学实验。本试剂盒适宜提取各种大小的质粒，对20 kb以下的质粒效果更佳。
用途
• 真核细胞转染
• 实验动物注射
• 常规分子生物学应用，如酶切、PCR、测序、转化、体外转录等
特点
• 高纯度：OD260/280=1.8~2.0，无基因组DNA、RNA和蛋白质污染，内毒素清除率达90%以上
• 快速简便：比传统方法大大节省时间
• 操作安全：无需苯酚/氯仿抽提或乙醇沉淀
• 批次稳定：采用质量可靠的进口硅胶吸附膜，遵循标准化生产流程，通过严格质检标准
产品组分及保存条件
| 成分 | 10次（D209-01） | 保存 |
| RNaseA（10mg/ml） | 750µl | -20℃ |
| 溶液S1 | 77 ml | 4℃ |
| 溶液S2 | 77 ml | 室温 |
| 溶液S3 | 77 ml | 室温 |
| 内毒素清除剂 | 25 ml | -20℃ |
| 漂洗液WB | 25 ml X 2 第一次使用前按说明加指定量乙醇 |
室温 |
| 洗脱缓冲液EB | 20 ml | 室温 |
| 离心吸附柱及收集管 | 10套 | 室温 |
【质量控制】
• 从200 ml过夜培养的大肠杆菌DH5α菌液中可提取约1 mg pEGFP-N1质粒
• 提取的质粒OD260/280值在1.9左右，转染HEK-293细胞，效率在90%以上
【保存条件】
本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。内毒素清除剂常温运输，4度可以保存一个月，长期保存放-20℃。
【注意事项】
1. 所有的离心步骤如未加另外说明均在室温完成，使用转速可以达到12,000 x g，带50ml转头的台式离心机。
2. 提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10 kb 的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加S1、S2、S3 的用量，洗脱缓冲液应在70℃预热。可以适当的延长吸附和洗脱的时间，以增加提取效率。
3. 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。
4. 质粒DNA确切分子大小， 必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以知道。处于环状或者超螺旋状态的的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其确切大小。
5. 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱，质粒应该保存在-20℃。质粒DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。
6. 第一次使用前请先在2瓶漂洗液WB中分别加入100ml无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入。
7. 将RNase A 全部加入溶液P1中，混匀，每次使用后置于2~8℃保存。
【操作步骤】
1. 取150-200 ml (最多不超过300 ml)过夜培养的菌液，12,000xg（约10,000rpm），离心1-2分钟，尽可能的倒干上清，收集菌体。
2. 收集超过50毫升菌液，可以离心弃上清后，在同一个50ml管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集到足够的菌体。
3. 用7.5 ml溶液S1重悬菌体沉淀，移液器吹打或者涡旋振荡至彻底悬浮。
如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
4. 加7.5 ml的溶液S2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解，室温放置4-5分钟。
温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠。如果很浑浊，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
5. 加7.5 ml溶液S3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀此时会出现白色絮状沉淀。12,000 x g离心10-15分钟，小心取上清至新管，避免吸取到漂浮白色沉淀。
加入溶液S3后应该立即混匀，以免产生SDS的局部沉淀。
6. 加入0.1体积(上清的体积的10%，约2.4ml)的内毒素清除剂到上一步所得上清，颠倒旋转混匀，冰浴或者插入碎冰中(或冰箱冷冻室)放置5分钟直到浑浊变清亮透明（或仍旧稍有浑浊），中间偶尔混匀几次。
内毒素清除剂加入上清后，上清会变得浑浊，但是冰浴后应恢复清亮（或稍浑浊）。
7. 常温放置3-5分钟，温度恢复室温溶液很快变为浑浊，颠倒混匀。
如室内温度较低或者想加快速度可以在37-42℃水浴，将很快变浑浊，颠倒混匀。
8. 室温8,000-10,000 x g离心10 分钟分相 。上层水相含DNA，下层蓝色油状相含内毒素和其它杂质。将含DNA的上层水相转移到新管（注意不要吸到蓝色油状层，里面含内毒素等杂质），弃油状层。
9. 向上层水相中加入0.5体积异丙醇（约11ml）后充分颠倒混匀后分多次（每次不超过15ml）转入吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12,000 x g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。直到所有混合溶液通过此吸附柱。
10. 加入10ml漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 x g离心1分钟，弃掉废液。再加入10ml漂洗液WB，重复漂洗一次。
11. 将吸附柱放回空收集管中，最高速（最好大于12,000 x g）离心3分钟以干燥基质膜上残留乙醇，用枪头吸除内圈压环和柱壁之间可能残留的乙醇，打开盖子室温晾干3-5分钟。
该步骤为彻底去除吸附柱中残留乙醇，残留乙醇抑制下游反应并且严重降低洗脱效率，降低质粒产量。
12. 取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加1-2ml洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中预热可提高产量），室温放置3分钟，12,000 x g离心3分钟。
推荐：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置3分钟，12,000 x g离心3分钟。洗脱两遍可提高浓度约10%。洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是需注意体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量（最小不应少于1ml）。
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文献和实验E.Z.N.A. Endo-Free Plasmid Mini Kit II Spin Protocol
with occasional mixing. Avoid vigorous mixing as this will shear chromosomal DNA and lower plasmid purity. (Store Solution II tightly capped when not in use.) 4. Add 250 ul ice-cold Buffer N3 and mix gently but throughly by inverting tube several times
E.Z.N.A.® Endo-free Plasmid Mini Kit I Spin Protocol
实验步骤 1. Inoculate 5ml LB/ampicillin (50 ug/ml) medium placed in a 10-20 ml culture tube with E.coli carrying desired plasmid and grow at 37°C with agitation for 12-16 h. It is strongly recommended that an endA negative
Fastfilter Plasmid Maxi Kit Spin Protocol
实验步骤 Growth of bacterial culture: 1. Culture volume: Inoculate 200 ml LB/ampicillin (50 ug/ml) medium placed in a 1-4 liter culture flask with E.coli carrying desired plasmid and grow at 37°C with agitation for 12-16
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