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菌落 PCR 试剂盒 2.050 次说明书
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上海一研
菌落 PCR 试剂盒 2.050 次说明书公司的RNA/DNA提取目录有下面10个系列，5000余种产品
1、RNA纯化系列产品
2、DNA纯化系列产品
3、电泳及回收系列产品
4、探针标记及检测系列产品
5、核酸扩增系列产品
6、克隆表达系列产品
7、基因组研究系列产品
8、蛋白质研究系列产品
9、细胞生物学研究系列产品
10、即用型溶液、质粒库、菌种库等等
菌落 PCR 试剂盒 2.050 次说明书技术优势
1. 能有效的处理土壤样品中一些很难处理的组分如： 真细菌孢子（eubacterial spores）、内芽孢（endospores）、格兰仕阳性菌（gram positive bacteria）、酵母（yeast）、线虫（nematodes）、海藻（algea）、真菌（fungi）等。
2. 样品处理过程中使用的 MT Buffer和Sodium Phosphate Buffer可在整个提取过程中有效的保护核酸，并最大限度的降低RNA污染。
3. 基于硅珠的纯化方法，可有效地去除腐植酸、多元酚等PCR抑制物
4. 纯化所得的DNA可直接用于PCR、酶切等后续实验之中。
5. 对腐植酸含量特别高的样品，附加额外的处理方法。
菌落 PCR 试剂盒 2.050 次说明书注意事项：
1.从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。
2．匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
3．分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600×g离心30-60分钟。
菌落 PCR 试剂盒 2.050 次说明书详细介绍：
菌落 PCR 试剂盒 2.050 次说明书操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c．细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。
3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。
9. 用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。
10.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可.不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl无RNase的水或0.5℅SDS,用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。
生物素标记组蛋白H3多肽（氨基：1-21） Biotinylated Histone H3 Peptide （residues 1-21） （100 ul）
Z-IETD-FMK， Caspase-8抑制剂（氟基酮） Z-IETD-FMK
Tovok BIBW2992 （Tovok）
S）-4，11-diethyl-3，4，12，14-tetrahydro-4-hydroxy-3，14-dioxo1H-pyrano[3’，4’:6，7]-indolizino[1，2-b]quinolin-9-yl-[1，4’biperidine]-1’-carboxylate， Hydrochloride Irinotecan Hydrochloride
N-[（2R）-2-（Hydroxamidocarbonylmethyl）-4-methylpentanoyl]-L-tryptophan methylamide； Galardin； Ilomastat GM 6001
DFOM， Deferoxamine methanesulfonate salt， Desferrioxamine mesylate salt Deferoxamine Mesylate
2，4-Difluoro-N-{2-（methyloxy）-5-[4-（4-pyridazinyl）-6-quinolinyl]-3-pyridinyl}benzenesulfonamide GSK-2126458
OA Okadaic acid
DZNep； NSC 617989； 5R- 3-Deazaneplanocin A
2’-（4-Ethoxyphenyl）-5-（4-methyl-1-perazinyl）-2，5’-bi-1H-benzimidazole trihydrochloride， HOE 33342， Hoechst 33342， bisBenzimide bisBenzimide H 33342
4-（6-{4-[3-（4-Hydroxymethyl-phenyl）-ureido]-phenyl}-4-morpholin-4-yl-pyrazolo[3，4-d]pyrimidin-1-yl）-peridine-1-carboxylic acid methyl ester mTOR Inhibitor， WYE-28
Sulfosuccinimidyl 6-（3’-[2-pyridyldithio]-propionamido）hexanoate Sulfo-LC-SPDP
Ac- Lys（Ac）-AMC HDAC Substrate， Fluorogenic
N-（7-cyano-6-（4-fluoro-3-（2-（3-（trifluoromethyl）phenyl）acetamido）phenoxy）benzo[d]thiazol-2-yl）cyclopropanecarboxamide TAK-632
（S）-3-（4-methoxyphenyl）-N-（（S）-1-（（R）-2-methyloxiran-2-yl）-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl）-2-（（S）-2-（2-morpholinoacetamido）propanamido）propanamide； PR-957 ONX-0914
4- AM580
CV 104； Covitol 1210； NSC 173849； d-α-Tocopherol Acid Succinate； α-Vitamin E Succinate； Vitamin E d-α-Tocosuccinate α-Tocopheryl succinate
Mouse IgG， 100 ug Mouse IgG
Bovine Serum Albumin – Cohn Fraction V， pH – 5.2 Bovine Serum Albumin – Cohn Fraction V， pH – 5.2Hepa 1-6, 小鼠肝细胞苏云金芽胞杆菌加拿大亚种 Bacillus thuringiensis subsp. canadensis
酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiaeHGC-27(人胃细胞)
香菇 Lentinula edodes酸球菌 Lactococcus lactis
CaCO2/结肠细胞苜蓿中华根瘤菌国产
酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiaeSGC7901(人胃细胞)
小单孢菌 Micromonospora sp.戊糖杆菌 Lactobacillus pentosus
人颅盖造骨细胞完全培养基毛柄金钱菌(金针菇) Flammulina velutipes
人间充质干细胞-脐带醋酸钙不动杆菌 Acinetobacter calcoaceticus
酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae3T3-L1(小鼠胚胎成纤维细胞)
豇豆慢生根瘤菌 Bradyrhizobium vigna挪威假丝酵母 Candida norvegensis
801-D (人巨细胞性肺细胞)根瘤菌 Rhizobium sp.
菌落 PCR 试剂盒 2.050 次说明书炭黑曲霉 Aspergillus carbonariusPA319(人大肠细胞)
费氏中华根瘤菌 Sinorhizobium fredii赭曲霉 Aspergillus ochraceus
kasumi-1, 人白血病细胞株双孢蘑菇 Agaricus bisporus
酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae胰蛋白酶-EDTA(含10mL 酶解缓冲液)
二色小单孢菌 Micromonospora bicolor小鼠骨髓基质细胞完全培养基
非洲爪蟾胚胎细胞植物杆菌 Lactobacillus plantarumACTE1
热带假丝酵母 Candida tropicalis费氏中华根瘤菌 Sinorhizobium fredii
冬虫夏草 Cordyceps sinensisMPC-11(小鼠浆细胞瘤)
小鼠小梁网细胞完全培养基少根根霉 Rhizopus arrhizus
人主动脉平滑肌细胞完全培养基光帽鳞伞 Pholiota nameko
葡萄汁酵母 Saccharomyces uvarum人咽鳞细胞
1、RNA纯化系列产品
2、DNA纯化系列产品
3、电泳及回收系列产品
4、探针标记及检测系列产品
5、核酸扩增系列产品
6、克隆表达系列产品
7、基因组研究系列产品
8、蛋白质研究系列产品
9、细胞生物学研究系列产品
10、即用型溶液、质粒库、菌种库等等
菌落 PCR 试剂盒 2.050 次说明书技术优势
1. 能有效的处理土壤样品中一些很难处理的组分如： 真细菌孢子（eubacterial spores）、内芽孢（endospores）、格兰仕阳性菌（gram positive bacteria）、酵母（yeast）、线虫（nematodes）、海藻（algea）、真菌（fungi）等。
2. 样品处理过程中使用的 MT Buffer和Sodium Phosphate Buffer可在整个提取过程中有效的保护核酸，并最大限度的降低RNA污染。
3. 基于硅珠的纯化方法，可有效地去除腐植酸、多元酚等PCR抑制物
4. 纯化所得的DNA可直接用于PCR、酶切等后续实验之中。
5. 对腐植酸含量特别高的样品，附加额外的处理方法。
菌落 PCR 试剂盒 2.050 次说明书注意事项：
1.从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。
2．匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
3．分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600×g离心30-60分钟。
菌落 PCR 试剂盒 2.050 次说明书详细介绍：
菌落 PCR 试剂盒 2.050 次说明书操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c．细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。
3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。
9. 用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。
10.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可.不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl无RNase的水或0.5℅SDS,用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。
生物素标记组蛋白H3多肽（氨基：1-21） Biotinylated Histone H3 Peptide （residues 1-21） （100 ul）
Z-IETD-FMK， Caspase-8抑制剂（氟基酮） Z-IETD-FMK
Tovok BIBW2992 （Tovok）
S）-4，11-diethyl-3，4，12，14-tetrahydro-4-hydroxy-3，14-dioxo1H-pyrano[3’，4’:6，7]-indolizino[1，2-b]quinolin-9-yl-[1，4’biperidine]-1’-carboxylate， Hydrochloride Irinotecan Hydrochloride
N-[（2R）-2-（Hydroxamidocarbonylmethyl）-4-methylpentanoyl]-L-tryptophan methylamide； Galardin； Ilomastat GM 6001
DFOM， Deferoxamine methanesulfonate salt， Desferrioxamine mesylate salt Deferoxamine Mesylate
2，4-Difluoro-N-{2-（methyloxy）-5-[4-（4-pyridazinyl）-6-quinolinyl]-3-pyridinyl}benzenesulfonamide GSK-2126458
OA Okadaic acid
DZNep； NSC 617989； 5R- 3-Deazaneplanocin A
2’-（4-Ethoxyphenyl）-5-（4-methyl-1-perazinyl）-2，5’-bi-1H-benzimidazole trihydrochloride， HOE 33342， Hoechst 33342， bisBenzimide bisBenzimide H 33342
4-（6-{4-[3-（4-Hydroxymethyl-phenyl）-ureido]-phenyl}-4-morpholin-4-yl-pyrazolo[3，4-d]pyrimidin-1-yl）-peridine-1-carboxylic acid methyl ester mTOR Inhibitor， WYE-28
Sulfosuccinimidyl 6-（3’-[2-pyridyldithio]-propionamido）hexanoate Sulfo-LC-SPDP
Ac- Lys（Ac）-AMC HDAC Substrate， Fluorogenic
N-（7-cyano-6-（4-fluoro-3-（2-（3-（trifluoromethyl）phenyl）acetamido）phenoxy）benzo[d]thiazol-2-yl）cyclopropanecarboxamide TAK-632
（S）-3-（4-methoxyphenyl）-N-（（S）-1-（（R）-2-methyloxiran-2-yl）-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl）-2-（（S）-2-（2-morpholinoacetamido）propanamido）propanamide； PR-957 ONX-0914
4- AM580
CV 104； Covitol 1210； NSC 173849； d-α-Tocopherol Acid Succinate； α-Vitamin E Succinate； Vitamin E d-α-Tocosuccinate α-Tocopheryl succinate
Mouse IgG， 100 ug Mouse IgG
Bovine Serum Albumin – Cohn Fraction V， pH – 5.2 Bovine Serum Albumin – Cohn Fraction V， pH – 5.2Hepa 1-6, 小鼠肝细胞苏云金芽胞杆菌加拿大亚种 Bacillus thuringiensis subsp. canadensis
酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiaeHGC-27(人胃细胞)
香菇 Lentinula edodes酸球菌 Lactococcus lactis
CaCO2/结肠细胞苜蓿中华根瘤菌国产
酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiaeSGC7901(人胃细胞)
小单孢菌 Micromonospora sp.戊糖杆菌 Lactobacillus pentosus
人颅盖造骨细胞完全培养基毛柄金钱菌(金针菇) Flammulina velutipes
人间充质干细胞-脐带醋酸钙不动杆菌 Acinetobacter calcoaceticus
酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae3T3-L1(小鼠胚胎成纤维细胞)
豇豆慢生根瘤菌 Bradyrhizobium vigna挪威假丝酵母 Candida norvegensis
801-D (人巨细胞性肺细胞)根瘤菌 Rhizobium sp.
菌落 PCR 试剂盒 2.050 次说明书炭黑曲霉 Aspergillus carbonariusPA319(人大肠细胞)
费氏中华根瘤菌 Sinorhizobium fredii赭曲霉 Aspergillus ochraceus
kasumi-1, 人白血病细胞株双孢蘑菇 Agaricus bisporus
酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae胰蛋白酶-EDTA(含10mL 酶解缓冲液)
二色小单孢菌 Micromonospora bicolor小鼠骨髓基质细胞完全培养基
非洲爪蟾胚胎细胞植物杆菌 Lactobacillus plantarumACTE1
热带假丝酵母 Candida tropicalis费氏中华根瘤菌 Sinorhizobium fredii
冬虫夏草 Cordyceps sinensisMPC-11(小鼠浆细胞瘤)
小鼠小梁网细胞完全培养基少根根霉 Rhizopus arrhizus
人主动脉平滑肌细胞完全培养基光帽鳞伞 Pholiota nameko
葡萄汁酵母 Saccharomyces uvarum人咽鳞细胞
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文献和实验相关实验
buffer，摸索镁离子浓度或适当加入 DMSO（小于 0.3%） · 提高退火温度，增加延伸时间（反应条件参照试剂盒说明书） 问题 2：假阳性 现象：空白对照出现条带 可能原因： · 引物设计不适，与目的序列具有同源性 · 试剂污染：水、移液枪等被核酸污染 · 样品间出现交叉污染 解决方法： · 实验仪器高压灭菌 · 实验试剂（酶除外）高压灭菌，离心管枪头一次性使用 · 规范实验操作 · 假阳性可通过巢式 PCR 解决，或者使用特异性较高的试剂盒扩增 问题 3：拖尾、弥散 现象：电泳出现拖尾、涂抹
和Topo平端的一样，含ccdB基因，所以同样可降低菌落背景，易于筛选。 表10 PCR 克隆 试剂盒的选择 Amplification Enzyme Application of Cloned PCR Product Ligation Method
Blunt PCR克隆乃利用传统T4连接酶方法，但载体和Topo平端的一样，含ccdB基因，所以同样可降低菌落背景，易于筛选。 表10 PCR克隆试剂盒的选择 Amplification Enzyme Application of Cloned PCR Product Ligation Method Product
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