快速实时荧光定量PCR预混体系(高含量ROX校正染料)大量库

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。

北京百奥莱博主要从事生物试剂的生产和销*(代"售")，产品线涵盖快速实时荧光定量PCR预混体系(高含量ROX校正染料)大量库存促销在内的分子生物学试剂产品，还包括PCR及荧光定量PCR、核酸提取试剂盒类、样本核酸保护试剂、核酸提取、克隆与转化、蛋白纯化、蛋白检测、免疫组化、细胞凋亡与抗体等。

名称：快速实时荧光定量PCR预混体系(高含量ROX校正染料)大量库存促销
产地：国产|进口
规格：5ml
编号：WE0143
品牌：百奥莱博
  本品是专用于染料法(SYBR GreenⅠ)实时荧光定量PCR的预混体系，浓度为2×,包含Fast Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs、SYBR Green I荧光染料和Mg2+，操作简单方便。主要用于基因组DNA靶序列和RNA反转录后的cDNA靶序列检测。本品所含荧光染料SYBR Green I可以与所有的双链DNA相结合，使该产品可用于不同靶序列的检测而不需合成特异性标记探针。本品含有的Fast Taq DNA Polymerase能有效减少在常温条件下由引物和模板非特异性结合或引物二聚体而产生的非特异性扩增，酶的激活仅需在95℃孵育20s。整个PCR反应过程比普通反应可节省约40分钟，大大缩短了PCR的反应时间。独特的PCR缓冲体系与热启动酶的组合，有效抑制了非特异产物的产生，并显著提高PCR的扩增效率。该产品应用范围广，适用于普通和快速定量PCR程序，可适用于无需ROX校正的所有荧光定量PCR仪。

  ROX染料用于校正定量PCR仪孔与孔之间产生的荧光信号误差，一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR 扩增仪。不同仪器的激发光学系统有所不同，因此ROX染料的浓度必须与相应的荧光定量PCR仪相匹配。
不需要ROX校正的仪器(WE0141)：
Roche LightCycler 480，Roche LightCyler 96，Bio-rad iCyler iQ，iQ5，CFX96等。
需要Low ROX校正的仪器(WE0142)：
ABI Prism7500/7500 Fast，QuantStudio® 3 System，QuantStudio® 5 System，QuantStudio® 6 Flex System，QuantStudio® 7 Flex System，ViiA 7 system，Stratagene Mx3000/Mx3005P，Corbett Rotor Gene 3000等。
需要High ROX校正的仪器(WE0143)：
ABI Prism7000/7300/7700/7900，Eppendorf，ABI Step One/Step One Plus等。

产品组成：

 

组份	WE0141-5ml	WE0142-5ml	WE0143-5ml
2×BaFaSYBR Mixture	5×1ml	5×1ml	5×1ml
50×Low ROX	-	200μl	-
50×High ROX	-	-	200μl
ddH2O	5×1ml	5×1ml	5×1ml

注意事项：
1、使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。
2、本产品中含有荧光染料SYBR Green I，保存本产品或配制PCR反应液时应避免强光照射。
3、避免反复冻融本品，反复冻融可能使产品性能下降。本产品长期保存可置于-20℃，避光。如果在短期内需要频繁使用，可在2～8℃保存。
4、本品不能用于探针法荧光定量PCR。

使用方法：
以下举例为常规PCR反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小不同进行相应的改进和优化。

1、PCR反应体系：
 

试剂	50μl反应体系	终浓度
2×BaFaSYBR Mixture	25μl	1×
Forward Primer，10μM	1μl	0.2μM
Reverse Primer，10μM	1μl	0.2μM
Template DNA	2μl
50×Low ROX or High ROX(可选)	1μl	1×
ddH2O	up to 50μl

注意：
1)通常引物浓度以0.2μM可以得到较好结果，可以在0.1-1.0μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。
2)通常DNA模板的量以10-100ng基因组DNA或1-10ng cDNA为参照，因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。
3)不同仪器的激发光学系统有所不同，根据使用荧光定量的仪器选择加入50×Low ROX or 50×High ROX.

2、PCR反应条件：
 

步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	20 s
变性	95℃	3 s	35-40个循环
退火/延伸	60℃	30 s
融解曲线分析	95℃	15 s
	60℃	1 min
	95℃	15 s
	60℃	15 s

注意：
1)本产品所采用的酶须在预变性95℃、20s条件下实现酶的活化。在此条件下，大多数模板可良好的进行解链。对GC含量高、二级结构复杂的模板，可将预变性时间延长至1分钟，以使起始模板充分解链。若高温处理时间过长，会对酶的活性造成影响。可根据模板情况确定最佳的预变性时间。
2)建议采用两步法PCR反应程序，退火温度请以60-64℃作为设定范围的参考，发生非特异性反应时，可提高退火温度。若因使用Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法PCR扩增，退火温度请以 56℃-64℃的范围作为设定参考。
3)融解曲线分析请以所使用的荧光定量PCR仪推荐的程序进行设定，本程序是以ABI 7500荧光定量PCR仪为参照设定。

储存条件：-20℃，避免反复冻融

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·RIPA裂解液(中)
编号：WE0257
英文名称：RIPA Lysis Buffer(Medium)
规格：100ml
  RIPA裂解液是一种传统的组织以及细胞快速裂解液，主要用于从动物组织和哺乳动物细胞中抽取可溶性蛋白，可用于裂解贴壁细胞和悬浮细胞。按照其裂解液的强度可以分为强、中、弱三类，具体特点和差异请参考附表2，可根据实验需求选择相应产品。经RIPA裂解液(中)提取的蛋白可应用于蛋白定量、Western Blot、IP等检测分析。
  RIPA裂解液(中)的主要成分为50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1% NP-40，0.5% sodiu*(代"m") deoxycholate，0.1% SDS，以及sodiu*(代"m") orthovanadate，sodiu*(代"m") fluoride，EDTA，leupeptin等多种抑制剂，可以有效抑制蛋白降解。


注意事项：
1、为防止蛋白降解，所有的操作尽量在冰上进行。
2、使用RIPA裂解液得到的蛋白样品，可采用BCA法进行蛋白定量，以测定蛋白浓度。产品可单独向本公司订购，如:WE0276 BCA蛋白定量试剂盒。本品含有高浓度的去垢剂，不能用Bradford法进行蛋白定量。
3、建议在使用RIPA裂解液前，向溶液中加入蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂，以防止蛋白降解，或保持蛋白的磷酸化状态。产品可单独向本公司订购，如:WE0259 蛋白酶抑制剂混合物，WE0256 磷酸酶抑制剂混合物。
4、若需获得更高浓度的蛋白，应减少哺乳动物蛋白抽提试剂的使用量。
5、对于培养瓶中的贴壁细胞，推荐先使用常规方法消化细胞，再参考悬浮细胞蛋白提取步骤操作。
6、对于离心获得的细胞，若不确定细胞体积，可根据细胞数量计算RIPA裂解液的使用量。如5×106个Hela细胞约需加入500μl RIPA裂解液，以此类推。

使用方法：

一、细胞样品
贴壁细胞蛋白抽提
1、小心倾去贴壁细胞的培养液。
2、可选步骤：若培养基中含有酚红或其他可能影响实验结果的物质，请先使用预冷的PBS漂洗细胞。
3、加入适量RIPA Lysis Buffer(Medium)(使用前2-3分钟内加入蛋白酶抑制剂)，试剂使用量请参考附表1，在冰上用枪头吹打贴壁细胞。

表1 贴壁细胞RIPA 裂解液使用量推荐表

细胞培养板类型或培养面积	RIPA 裂解液使用量
100 mm	500-1000μl
60 mm	250-500μl
6孔培养板	200-400μl /孔
24孔培养板	100-200μl /孔
96孔培养板	50-100μl /孔

4、将裂解液转移至新的离心管中，冰上孵育20分钟，使细胞充分裂解。
5、14000×g离心10分钟。转移上清液至新管中，进行下一步分析。

悬浮细胞蛋白提取
1、悬浮细胞，2,500×g离心5分钟，弃去上清。
2、可选步骤：若培养基中含有酚红或其他可能影响实验结果的物质，请使用PBS漂洗细胞。漂洗后的细胞悬浮液2,500×g离心5分钟，弃去上清。
3、加入适量RIPA Lysis Buffer(Medium)(使用前2-3分钟内加入蛋白酶抑制剂)，每5×106细胞加入约200-500μl RIPA Lysis Buffer(Medium)，吹打均匀。
4、冰上放置20分钟，使细胞充分裂解。
5、14000×g离心10分钟。转移上清液至新管中，进行下一步分析。

二、组织样品
1、取适当的RIPA Lysis Buffer(Medium)，在使用前2-3分钟内加入蛋白酶抑制剂。
2、称量实验组织的重量，按照1:10(g/ml)的比例加入RIPA Lysis Buffer(Medium)后将组织剪成细小碎片，用电动匀浆器匀浆处理。若需要浓缩的蛋白提取物，可适当减少组织蛋白抽提试剂使用量。
3、冰上孵育20分钟，使细胞充分裂解。
4、14000×g 离心10分钟。转移上清液至新管中，进行下一步分析。
注：RIPA裂解液的裂解产物中可能会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为基因组。

表2 蛋白裂解液性能、参数比较
 

目录号	WE0258	WE0257
名称	RIPA裂解液(强)	RIPA裂解液(中)	RIPA裂解液(弱)	SDS裂解液
裂解强度	强	中	温和	强
有效裂解成分	1%Triton X-100， 1%脱氧胆酸*, 0.1% SDS	1% NP-40， 0.5%脱氧胆酸* , 0.1% SDS	1% NP-40， 0.25%脱氧胆酸*	1%SDS
膜蛋白提取	很好	较好	一般	很好
胞浆蛋白提取	很好	很好	很好	很好
核蛋白提取	很好	较好	较好	很好
主要用途	WB，IP	WB，IP	WB，IP，CO-IP	WB，CHIP

储存条件：2～8℃

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