FITC标记驴抗兔IgG(H+L) FITC标记抗体

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北京百奥莱博专业生产销*(代"售")FITC标记驴抗兔IgG(H+L) FITC标记抗体，我公司供应的抗体抗原品类齐全，且具有优势价格，欢迎新老客户垂询订购。

名称：FITC标记驴抗兔IgG(H+L) FITC标记抗体
产地：国产|进口
编号：WE0365
品牌：百奥莱博
英文名：Donkey Anti-Rabbit IgG,FITC Conjugated
本产品为FITC标记的经亲和纯化的驴抗体，特异识别兔IgG，检测灵敏度高，本底低，常用于免疫荧光和流式细胞等标记检测。FITC即硫*酸荧光素，为一种常用的荧光染料，常用于免疫荧光和流式细胞检测等多标记检测。

免疫原：兔IgG
缓冲液：0.01M PBS，50%甘油，pH7.6
稳定剂：15 mg/ml BSA(不含IgG和蛋白酶)
防腐剂：0.05%叠氮*
荧光团：FITC，Amax=492; Emax=520
应用范围：对于大多数实验(1：50-200)

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亲和硅烷 Xylanase
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·二代测序DNA快速建库试剂盒(Illumina平台)
编号：WE0229
英文名称：NGS Fast DNA Library Prep Set for Illumina
规格：24次|96次
  本试剂盒提供了DNA文库构建所需要的酶预混体系及反应缓冲液，包含除接头与PCR引物外的所有成分，用于illumina二代测序平台DNA文库构建。和一般建库方法相比，该试剂盒操作简单、方便，极大地缩短了文库构建时间。另外，试剂盒采用高保真DNA聚合酶进行文库富集，无偏好的PCR扩增，扩大了序列的覆盖区域，可高效制备用于illumina二代测序平台的DNA文库。试剂盒中提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度上保证了文库构建的稳定性。

试剂盒组成：

 

组份	24次	96次
End Prep Enzyme Mix	48μl	192μl
10x End Repair Reaction Buffer	200μl	800μl
T4 DNA ligase	48μl	192μl
T4 DNA ligase Buffer	400μl	2×800μl
HiFidelity 2×PCRMasterMix	600μl	2×1.2ml

试剂盒特点;
1、末端补平，磷酸化，加A一步完成。
2、不需纯化，直接加接头。
3、超保真扩增，最大程度上降低了扩增偏好性。
4、支持多种样本，且所得文库能够用于Illumina GAIIx，HiSacnSQ、HiSeq 2500/2000/1000和MiSeq sequencing等测序平台的测序。

自备仪器、试剂和耗材：
1、磁力架：建议使用DynaMagTM-2(货号： 12321D)。
2、DNA纯化回收试剂盒：建议使用百奥莱博磁珠法DNA纯化回收试剂盒(货号： WE0205)。
3、样本接头引物试剂盒：建议使用百奥莱博二代测序多样本接头引物试剂盒 I/II(货号：WE0241/WE0240)。
4、无水乙醇，EB(10 mM Tris-HCl, pH 8.0)，去离子水(pH 在7.0-8.0之间)。
5、反应管：建议使用低吸附的PCR管与1.5ml离心管；枪头：建议使用高质量过滤枪头防止试剂盒、文库样本污染

实验前准备及重要注意事项/strong>：
1、避免试剂的反复冻融，建议您首次使用试剂盒后将剩余试剂分装保存。
2、PCR产物因操作不当极易产生污染，导致实验结果不准确，建议将PCR反应体系配制区与PCR产物纯化区隔离，并使用专门的移液器，定时对各实验区域进行清洁。

DNA建库流程示意图：



操作步骤：

样本要求： 5ng-1μg打断的双链DNA，溶于EB(10 mM Tris-HCl pH 8.0)或去离子水中。DNA纯度要求：OD260/OD280=1.8~2.0。

DNA末端修复反应：
1、向200μl PCR管中加入以下试剂：

试剂	体积
10×End Repair Reaction Buffer	6.5μl
End Prep Enzyme Mix	2μl
fragmented DNA	X(5ng-1μg)
RNase-free Water	Up to 65μl

2、用枪头将上述溶液轻轻吹吸混匀，短暂离心,使所有组分收集到管底。
3、将上述PCR管置于PCR仪中，热盖打开， 反应程序如下：
15 min @ 12℃
15 min @ 37℃
20 min @ 72℃

Adaptor 连接：
建议使用百奥莱博adaptor进行连接，也可选择使用NEB、illumina公司的adaptor，具体连接方法可参考各公司的产品使用说明书。以下为使用百奥莱博adaptor进行连接的操作步骤：
1、向上述已完成DNA末端修复的反应液中直接加入以下试剂：

试剂	体积
T4 DNA ligase buffer for illumina	14μl
T4 DNA ligase	2μl
Adaptor	2.5μl

此时管中溶液总体积为83.5μl。
注意：若起始样本量少于100ng，请将adaptor用去离子水稀释10倍至1.5μM后使用。
2、用枪头将上述试剂吹吸混匀，短暂离心，使溶液收集到管底。
3、20℃温浴15分钟。
注意：若此操作使用pcr仪，请将热盖关闭。

DNA片段的选择性回收：
  建议使用百奥莱博磁珠法DNA纯化回收试剂盒(WE0205)进行DNA片段选择性回收。
注意：DNA片段选择性回收是可选步骤，若起始样本量低于50ng，不建议进行DNA片段选择性回收，直接进行DNA片段的纯化。另外构建不同大小的DNA文库时，DNA片段选择性回收的磁珠使用量不同，具体磁珠用量可参照附表1(若使用除百奥莱博以外厂家的磁珠，需自行摸索最佳磁珠用量)。
  以下操作步骤中，可选择回收DNA片段长度峰值为320bp(插入片段长度200bp)，反应起始体积为100μl。
1、涡旋振荡MCPure20秒，使其彻底混匀为均一溶液。
2、向连接反应液中加入16.5μl去离子水，使adaptor连接反应缓冲液体积至100μl。
注意：若使用NEB adaptor，只需要加入13.5μl去离子水。
3、将上述adaptor反应缓冲液转移至一新的1.5ml离心管中。
4、加入70μl混合均匀的MCPure，涡旋震荡5秒钟后, 室温静置5分钟。
5、短暂离心，将离心管置于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清(约需5分钟)，小心地将上清溶液转移至新的1.5ml离心管中,并弃去磁珠。
注意：不要弃除上清。
6、向上清中加入25μl混合均匀的MCPure，涡旋震荡5秒钟后室温放置5分钟。
7、短暂离心，将离心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清(约需5分钟)，小心吸取上清并弃除，期间避免接触已结合目标DNA的磁珠。
注意：不要弃除磁珠。
8、继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入250μl新配置的80%乙醇，室温放置30秒，待悬起的磁珠完全吸附后，小心弃除上清。
9、重复步骤8。
10、保持离心管固定于磁力架上，室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥。
11、将离心管从磁力架上取下，加入28μl 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)或去离子水(自备)，涡旋振荡使磁珠完全重悬于洗脱液中，室温静置5分钟。
12、短暂离心，将离心管放于磁力架上直至溶液澄清(约需5分钟)，将23μl洗脱液转移至一个新的PCR管中；
注意：一定不要转移磁珠，微量磁珠污染可影响后续PCR反应的正常进行。

另一种方案： DNA片段的纯化：
1、涡旋振荡MCPure20秒，使其彻底混匀为均一溶液。
2、将adaptor连接反应液转移至一新的1.5ml离心管中。
3、加入1倍样品体积的MCPure，涡旋震荡5秒钟后，室温静置5分钟。
4、短暂离心，将离心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清(约需5分钟)，小心吸取上清并弃除，期间避免接触已结合目标DNA的磁珠。
注意：不要弃除磁珠。
5、继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入250μl新鲜配置的80%乙醇，室温放置30秒，待悬起的磁珠完全吸附后，小心弃除上清。
6、重复步骤5。
7、保持离心管固定于磁力架上，室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥。
8、将离心管从磁力架上取下，加入28μl EB(自备)或去离子水，涡旋振荡使磁珠完全重悬于洗脱液中，室温静置5分钟。
9、短暂离心，将离心管放于磁力架上直至溶液澄清(约需5分钟)，将23μl洗脱液转移至一个新的PCR管中。

附表1：不同片段选择回收时磁珠建议用量

DNA文库大小	插入片段	150bp	200bp	250bp	300-400bp	400-500bp	500-700bp
	插入片段+adaptor	270bp	320bp	400bp	400-500bp	500-600bp	600-800bp
磁珠用量	第一次选择	85	70	55	50	45	35
	第二次选择	25	25	20	20	20	15

PCR扩增：
1．在PCR管中加入以下试剂并混匀。

试剂	体积
连接adaptor后的DNA片段	23μl
2×HiFid elity PCR Mix	25μl
Univesial primer	1μl
Index primer	1μl
总体积	50μl

2、PCR反应条件：

步骤	温度	时间	循环数
预变性	98℃	30 s
变性	98℃	10 s	6-16个循环
退火	65℃	30 s
延伸	72℃	30 s
终延伸	72℃	5 min

注意：建议1μg样本起始量时PCR循环数为6个循环，50ng时10个循环，5ng时14-15个循环，PCR循环数也可根据实验需要进行优化。

PCR产物的纯化：
1、涡旋振荡MCPure20秒，使其彻底混匀为均一溶液。
2、将PCR反应液转移至一新的1.5ml离心管中。
3、加入1倍样品体积的MCPure，涡旋震荡5秒钟后室温静置5分钟。
4、短暂离心，将离心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清(约需5分钟)。小心吸取上清并弃除，期间避免接触已结合目标DNA的磁珠。
注意：不要弃除磁珠。
5、继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入250μl新鲜配置的80%乙醇，室温放置30秒，待悬起的磁珠完全吸附后，小心弃除上清。
6、重复步骤5。
7、保持离心管固定于磁力架上，室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥。
8、将离心管从磁力架上取下，加入30μl EB(自备)或去离子水，涡旋振荡使磁珠完全重悬于洗脱液中，室温静置5分钟。
9、短暂离心，将离心管放于磁力架上直至溶液澄清(约需5分钟)，将洗脱液转移至一个新的PCR管中约25μl，DNA文库在-20℃保存。

文库质量检测

文库浓度：
  为了得到高质量的测序结果，需要对DNA文库进行精确定量，首先推荐使用Real-time PCR方法对DNA文库进行绝对定量。此外，还可使用荧光染料法，如Qubit法或荧光染料picogreen法，此处请勿使用基于吸光度测量的定量方法。最终可使用以下近似公式换算DNA文库的摩尔浓度。

文库平均总长度	近似转换公式	成簇反应DNA文库浓度
200 bp	1ng/μl=7.5 nM	6-12 pM
300 bp	1ng/μl=5.0 nM	6-12 pM
400 bp	1ng/μl=3.8 nM	6-12 pM
500 bp	1ng/μl=3.0 nM	6-12 pM

文库长度分布
制备好的DNA文库可用琼脂糖凝胶电泳或Agilent 2100 Bioanalyzer检测DNA文库中的片段长度分布范围。


图1：Agilent 2100 Bioanalyzer文库分析结果
L：DNA Ladder；
S：使用200ng人基因组DNA构建文库，磁珠进行选择回收后结果。

文库结构
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT [Target Sequence] TGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’
NNNNNN：index, 6bases

储存条件：-20℃


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·尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶)
编号：WE0115
英文名称：Uracil-N-Glycosylase(UNG)
规格：200U|1000U
  尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)也称为尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶)，通过大肠杆菌表达纯化的重组酶，该蛋白分子量为25kD，可催化含尿嘧啶的单链和双链DNA释放游离尿嘧啶，并且对RNA无活性，主要应用于防止PCR扩增产物的污染。该酶作用机理为：在PCR反应中以dUTP代替dTTP，扩增产物片段中的T全部被U取代，形成了含dU碱基的PCR扩增产物。UNG酶能选择性断裂单链和双链DNA中U碱基的糖苷键，降解反应体系中含U的DNA，有效消除PCR产物的残留污染，大大降低扩增产物污染导致的假阳性，从而保证扩增的特异性和准确性。

活性定义：37℃，60分钟内催化1 nmol尿嘧啶，从含尿嘧啶的DNA上释放所需要的酶量定义为一个单位。

质量控制：SDS-PAGE检测纯度大于95%；经检测无核酸内、外切酶活性。

注意事项：
1、UNG长期储存(非频繁使用; 每月少于3次)请置于-70℃保存，每天或每周使用请于-20℃保存。尽量避免反复冻融，大包装建议分装使用。
2、UNG可以在PCR反应前先清除不慎污染的U-DNA分子，一个实验室必须在所有的PCR反应中使用dUTP作为dNTP之一，使所有扩增产物都成为U-DNA。如单使用于某个检测，T-DNA仍会积累，此抗污染系统也难以起到完全的作用。
3、UNG/dUTP系统是PCR试剂内部的一种防污染措施，为了防止PCR产物的污染，尤其是在临检实验室中反复放大同一片段时，必须严格规范实验室的划分和操作。

使用方法：
以下举例为Taq反应体系防止PCR产物污染的使用方法，实际应用可应根据具体实验进行改进和优化。

1、PCR反应体系

试剂	50μl反应体系	终浓度
Taq PCR Buffer，10×	5μl	1×
dATP，10 mM	1μl	200μM
dGTP，10 mM	1μl	200μM
dCTP，10 mM	1μl	200μM
dTTP，10 mM	0.5μl	100μM
dUTP，10 mM	1μl	200μM
Forward Primer，10μM	1μl	0.2μM
Reverse Primer，10μM	1μl	0.2μM
Template DNA	Xμl
Taq DNA Polymerase，5 U/μl	0.5μl	2.5 U/50μl
Uracil-N-Glycosylase，1 U/μl	0.2μl	0.2 U/50μl
ddH2O	up to 50μl

2、反应条件

步骤	温度	时间	循环数
UNG消化	37℃-50℃	5-10 min
预变性	95℃	10 min
变性	94℃	30 s	30-40个循环
退火	55-65℃	30 s
延伸	72℃	1 kb/min
终延伸	72℃	5 min

注意：通常将Taq酶与UNG酶按一定的比例加入PCR反应体系中，先于37℃-50℃范围内消化5-10分钟，然后95℃ 10分钟灭活，(同时这一步也达到预变性和热启动的效果)，随后进行PCR扩增。UNG酶的反应可以在37℃-50℃，5-10分钟的范围内变化，可以根据实验的需要进行调整。

储存条件：-20℃，避免反复冻融。

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