北京一步法Real-Time RT-qPCR试剂盒(低含量R

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。

北京百奥莱博主要从事生物试剂的生产和销*(代"售")，产品线涵盖北京一步法Real-Time RT-qPCR试剂盒(低含量ROX校正染料)品牌在内的分子生物学试剂产品，还包括PCR及荧光定量PCR、核酸提取试剂盒类、样本核酸保护试剂、核酸提取、克隆与转化、蛋白纯化、蛋白检测、免疫组化、细胞凋亡与抗体等。

名称：北京一步法Real-Time RT-qPCR试剂盒(低含量ROX校正染料)品牌
规格：100次
产地：国产|进口
编号：WE0138
品牌：百奥莱博
  本试剂盒是一步法Real-Time RT-qPCR专用试剂盒。所含的SYBR Green I荧光染料可以与所有的双链DNA相结合，使该产品可以用于多种不同靶序列的检测而不需合成特异性标记探针。使用本产品进行Real Time RT-qPCR反应，逆转录和定量PCR在同一反应体系中进行，反应过程中无需添加试剂，无需打开管盖，避免了污染的同时提高了实验效率。全新高效逆转录酶RNase H活性缺失，减少了逆转录反应中RNA的降解。该酶逆转录效率高，可对少量 RNA模板进行良好的逆转录反应。与RNA亲合性高，能通读GC含量高，二级结构复杂的RNA模板。全新高效热启动酶，在常温下酶的活性被封闭，从而有效避免在常温条件下由引物和模板非特异性结合或引物二聚体而产生的非特异性扩增，极大提高了荧光定量PCR反应的精确性。所包含的缓冲系统使以上两种酶同时发挥最大功效，提高效率。本产品灵敏度高，特异性高，线性范围广，对目的基因定量更准确。

ROX染料用于校正定量PCR仪孔与孔之间产生的荧光信号误差，一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR 扩增仪。不同仪器的激发光学系统有所不同，因此ROX染料的浓度必须与相应的荧光定量PCR仪相匹配。

不需要ROX校正的仪器:(WE0137)
Roche LightCycler 480，Roche LightCyler 96，Bio-rad iCyler iQ，iQ5，CFX96等。
需要Low ROX校正的仪器：(WE0138)
ABI Prism7500/7500 Fast，QuantStudio® 3 System，QuantStudio® 5 System，QuantStudio® 6 Flex System，QuantStudio® 7 Flex System，ViiA 7 system，Stratagene Mx3000/Mx3005P，Corbett Rotor Gene 3000等。
需要High ROX校正的仪器：(WE0139)
ABI Prism7000/7300/7700/7900，Eppendorf，ABI Step One/Step One Plus等。

试剂盒组成：

 

组份	WE0137-100次	WE0138-100次	WE0139-100次
2×SuperSYBR One Step Buffer	1.4ml	1.4ml	1.4ml
SuperSYBR One Step EnzymeMix	50μl	50μl	50μl
50×Low ROX	-	50μl	-
50×High ROX	-	-	50μl
RNase-Free Water	1.5ml	1.5ml	1.5ml

注意事项：
1、本试剂盒中的各试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。
2、本产品以RNA为模板进行一步法RT-PCR实验，在操作过程中应避免RNase污染，建议在专门的区域进行RNA操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并经常更换手套，实验相关耗材应用0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理12小时,并高压灭菌30分钟后使用。
3、SuperSYBR One Step RT-qPCR Buffer中含有SYBR Green I 荧光染料，保存本产品或配制PCR反应液时应避免强光照射。
4、本试剂盒中的各试剂应避免反复冻融，反复冻融可能使产品性能下降。本产品长期保存可置于-20℃，避光。如果在短期内需要频繁使用，可在2～8℃保存。
5、本试剂盒必须使用特异性引物，引物的选择可根据具体实验来选择，引物设计的好坏直接影响到RT-PCR反应的结果，设计引物时需考虑GC含量，引物长度，引物位置，PCR产物的二级结构等因素，建议采用专业的引物设计软件进行设计。
6、本品不能用于探针法荧光定量PCR。

操作步骤：
1、将RNA模板、引物、2×SuperSYBR One Step Buffer、SuperSYBR One Step EnzymeMix和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
2、PCR反应体系
 

试剂	25μl反应体系	终浓度
2×SuperSYBR One Step Buffer	12.5μl	1×
Forward Primer，10μM	0.5μl	0.2μM
Reverse Primer，10μM	0.5μl	0.2μM
SuperSYBR One Step EnzymeMix	0.5μl
RNA Template	Xμl	10 pg～100ng
50×Low ROX or High ROX(optional)	0.5μl	1×
RNase-Free Water	up to 25μl

注意：
1)通常引物浓度以0.2μM可以得到较好结果，可以终浓度0.1-0.5μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。
2)不同仪器的激发光学系统有所不同，根据使用荧光定量的仪器选择加入50×Low ROX or 50×High ROX。

3、涡旋震荡混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。
4、RT-qPCR反应条件(荧光定量PCR为两步法)，本程序是以ABI 7500荧光定量PCR仪为例。
 

步骤	温度	时间	循环数
反转录	45℃	10 min
PCR预变性	95℃	5 min
变性	95℃	10 s	30-40个循环
退火/延伸	60℃	45 s
融解曲线分析	95℃	15 s
	60℃	1 min
	95℃	15 s
	60℃	15 s

注意：
1)建议采用两步法PCR反应程序，若提高反应特异性，可提高退火温度，以60-64℃作为设定范围的参考；若因使用Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法PCR扩增。
2)融解曲线分析请以所使用的荧光定量PCR仪推荐的程序进行设定，本程序是以ABI7500荧光定量PCR仪为参照设定。

RT-qPCR反应条件(荧光定量PCR为三步法)：
 

步骤	温度	时间	循环数
反转录	45℃	10min
PCR预变性	95℃	5min
变性	95℃	15s	30-40 个循环
退火	56℃-64℃	30s
延伸	72℃	30s
融解曲线分析	95℃	15s
	60℃	1min
	95℃	15s
	60℃	15s

注意：
1)三步法PCR扩增时，退火温度请以 56℃-64℃的范围作为设定参考。
2)融解曲线分析请以所使用的荧光定量PCR仪推荐的程序进行设定，本程序是以ABI 7500荧光定量PCR仪为参照设定。

储存条件：-20℃，避免反复冻融

北京一步法Real-Time RT-qPCR试剂盒(低含量ROX校正染料)品牌极具性价比，此外，我公司正火爆促销以下产品：
ARB12500 大鼠神经营养因子4(NT-4)含量检测 Rat neurotrophin 4,nt-4 ELISA KIT
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*甲基树脂 β- NADP
75621-03-3 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲*基]丙磺酸内盐 CHAPS
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α-*乙酸* Boc-D-Asp-OH 15165-79-4
9031-11-2 β-半乳糖苷酶 β-galactosidase
16423-68-0 赤藓红B(四碘荧光素)Erythrosin B
BOC-L-亮*酸 Amberlite 719 13139-15-6
虎红 Merrifield resin 632-69-9
褪黑素 Paraffin oil 73-31-4
ARB10862 人抗结核杆菌(TB-Ab)elisa检测 Human anti-tubercle bacilli ,tb-ab ELISA KIT
PY02-397  APT琼脂  250克  
F030641 FITC标记小鼠抗鸡IgY(IgG)抗体 Monoclonal Mouse Anti-Chicken IgY*FITC
T104 Taq Platinum DNA Polymerase
2,2’-联喹*(代"啉")-4,4’-二羧酸* Trans-zeatin Riboside 979-88-4
北京一步法Real-Time RT-qPCR试剂盒(低含量ROX校正染料)品牌关键词：WE0138,一步法Real-Time RT-qPCR试剂盒(低含量ROX校正染料),SuperSYBR One Step RT-qPCR Kit(Low ROX)


·TA快速连接试剂盒(pUC-T)
编号：WE0249
英文名称：pUC-T TA Cloning Kit
规格：20次
  pUC-T TA载体是一种高效克隆PCR产物的专用载体，它是由pUC18载体在EcoR V酶切位点处切开，在两侧的3"端添加T而成。由于大部分耐热聚合酶反应时都会在PCR产物的3"端添加一个A，它可以与pUC-T 3"端的T互补连接，因此可大大提高PCR产物的连接和克隆效率。
  试剂盒中配备高效率的T4 DNA Ligase和为快速高效DNA连接优化的2×Quick Ligation Reaction Buffer。连接效率相当于用T4 DNA Ligase 进行常规连接1小时。带有插入片段的重组子可根据α互补原理，进行蓝白斑筛选，判断载体中有无外源基因的插入。克隆后可以用BcaBEST Sequencing Primers和 M13通用引物对PCR产物进行测序。

试剂盒组成：

组份	20次
pUC-T(50ng/μl)	20μl
Control Insert(50ng/μl)	10μl
Quick T4 DNA Ligase	20μl
2×Quick Ligation Reaction Buffer	120μl

注意事项：

1、Insert DNA 要求
1)连接使用的PCR片段3’末端应带有“A”尾。有些高保真DNA聚合酶，如我公司的Pfu扩增的PCR产物是平滑末端，可使用加A试剂盒加上A尾后，再进行T载体克隆。
2)PCR产物建议进行切胶回收纯化后再进行T载体克隆，以免PCR产物中的非特异片段或残存引物等杂质影响。推荐使用WE0168快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。

2、连接反应要求
1)本试剂盒能使大多数连接反应在25℃条件下5分钟甚至更短时间内达到反应终点，增加反应时间反应效率不会增强。如用快速连接反应1小时后，转化效率会明显降低；如25℃快速连接反应过夜，则转化效率会下降到75%。
2)2×Quick Ligation Reaction Buffer含有ATP，使用前置于冰上使其融化后充分混匀，建议初次使用分装成小管冻存，避免其反复冻融影响DNA连接效率。
3)由于T4 DNA Ligase中含有甘油，比较粘稠容易挂壁，建议使用之前短暂离心将液体收集到管底，取样时枪头尽量不要深入液面太深，以免粘在枪头上造成损失。
4)如快速连接产物用于电转，因快速连接反应体系中的PEG会影响电转效率，建议使用离心柱将连接产物进行DNA纯化(如WE0170快速DNA产物纯化试剂盒)后再进行电转。

3、感受态细胞要求
建议使用高效的热击转化感受态细胞，这样才可能得到比较理想的阳性克隆，如需进行蓝白筛选，宿主细胞必须具有正确的基因型(F´编码的【lacZ ΔM15】)产生ω片段，才能与载体DNA产生的LacZ α 多肽结合，表现出β-半乳糖苷酶活性(α互补)。pUC-T TA载体以pUC18载体为基础构建而成，因此，适合pUC18载体的感受态细胞都可以使用。推荐使用本公司WE0251 TOP10感受态细胞、WE0252 DH5α感受态细胞。

4、阳性克隆筛选
阳性DNA片段成功插入至pUC-T Vector中后，一般情况下β-半乳糖苷酶的表达将受到破坏，重组克隆体在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB固体培养基上培养时将显示白色菌落。但有时比较短的DNA片段插入载体时，基因的读码框有可能正好与LacZ的读码框相吻合，克隆体也会显示蓝色菌落。

5、阳性对照
为了确认实验操作的正确性，以及实验试剂的有效性，我们建议使用本试剂盒中配备的Control Insert(750 bp)进行阳性对照实验。

使用方法：

1、按以下体系配制反应液：

成分	反应体系	对照体系
pUC-T	1μl	1μl
DNA 插入片段	0.1 -0.3 pmol	--
Control Insert DNA	--	1μl
2×Quick Ligation Reaction Buffer	5μl	5μl
Quick T4 DNA Ligase	1μl	1μl
RNase -Free Water	补足至10μl	补足至10μl

注：Insert DNA的使用量：在进行克隆时，Vector DNA和 Insert DNA的摩尔比一般为：1:2-1:10，可根据实验情况选择适当的Vector DNA和 Insert DNA的摩尔数比。Insert DNA的使用量=nmol数×660×Insert DNA bp数。本载体1μl(50ng)的摩尔数约为0.03 pmol。

2、轻轻混合，短暂离心。25℃反应5分钟。
注意：反应时间不要超过15分钟，否则会降低连接效率。
3、反应结束后，将DNA连接产物存放于0-4℃，而后进行转化实验；也可将DNA连接产物置于-20℃保存。
注意：勿进行加热失活反应。
4、将连接产物加入50μl感受态细胞中(将感受态细胞置于冰上融化)，冰浴30分钟。
注意：用化学法转化时，连接产物的加入量不要超过感受态细胞体积的10%。
5、42℃热击45秒钟，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。
6、加入450μl无菌SOC或LB培养基，混匀后置于37℃摇床，150 rpm振荡培养45分钟，使菌体复苏。
7、根据实验要求，取适量已转化的感受态细胞，加到含有X-Gal、IPTG和Amp的LB固体培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃，直至液体被吸收后，倒置培养，37℃培养12-16小时。
8、计算白、蓝色菌落，挑选白色菌落，使用PCR法或酶切法鉴定插入片段是否正确。



储存条件：-20℃。


北京一步法Real-Time RT-qPCR试剂盒(低含量ROX校正染料)品牌关键词：WE0138,一步法Real-Time RT-qPCR试剂盒(低含量ROX校正染料),SuperSYBR One Step RT-qPCR Kit(Low ROX)


·山羊抗兔IgG(H+L)
编号：WE0380
英文名称：Goat Anti-Rabbit IgG
规格：100μl
本产品为经抗原亲和纯化未标记的山羊抗兔IgG抗体，特异识别兔IgG，可与各种酶、荧光素等标记后用于免疫学、分子生物学及临床医学各个学科中，具有特异、敏感和安全的特点。

免疫原：兔IgG
缓冲液：0.01M PBS，50%甘油，pH7.6
抗体浓度：2 mg/ml
防腐剂：无

·高效无内毒素质粒大量提取试剂盒
编号：WE0167
英文名称：NoEndo Plasmid Maxi Kit
规格：2次|10次
  本试剂盒提供一种简单快捷高效提取无内毒素质粒的新方法，在碱裂解法裂解细胞的基础上，采用独特的硅基质膜吸附技术，高效专一结合质粒DNA；同时采用特殊的缓冲液系统和除内毒素过滤器，有效去除内毒素、基因组DNA、RNA、蛋白等杂质。本试剂盒所得质粒纯度高、提取量大，特别适用于细胞转染，同时也可用于DNA测序，PCR，体外转录，内切酶消化等实验。

  为什么使用本试剂盒？：内毒素是质粒提取中常见的污染物，由于真核细胞对内毒素非常敏感，因此，如果质粒中含有内毒素会大大降低真核细胞转染效率。

试剂盒组成：

组份	2次	10次
Buffer P1	30ml	125ml
Buffer P2	30ml	125ml
Buffer E3	30ml	125ml
Buffer PS	15ml	30ml
Buffer PW(浓缩液)	10ml	50ml
Endo-Free Buffer EB	10ml	30ml
RNase A(10 mg/ml)	600μl	2ml
推柄	2个	10个
内毒素过滤器FQ	2个	10个
吸附柱DQ及收集管	2套	10套
离心管(50ml)	2个	10个

自备试剂：无水乙醇、异丙醇。

实验前准备及重要注意事项/strong>：
1、所有组分可在干燥、室温(15～30℃)环境稳定保存1年，将吸附柱置于2～8℃可保存更长时间，加入RNase A的Buffer P1 置于2～8℃可稳定保存6个月。
2、Buffer P1 在使用前先加入RNase A(将试剂盒中提供的RNase A 全部加入)，混匀，置于2–8℃保存。使用前需在室温中放置一段时间，恢复至室温后使用。
3、第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer PW中加入无水乙醇。
4、使用前请先检查Buffer P2 和Buffer E3是否出现结晶或沉淀，如有结晶或沉淀现象，可在37℃水浴几分钟，即可恢复澄清。
5、注意Buffer P2和Buffer E3含有刺激性物质，请戴手套操作，使用后应立即盖紧盖子。
6、使用Buffer PS处理过的吸附柱最好立即使用，避免放置时间过长影响使用效果。
7、提取质粒的量和纯度与细菌培养浓度、菌株种类、质粒大小、质粒拷贝数等因素有关。

操作步骤：
1、取150ml过夜培养的菌液，加入离心管(自备)中，12000×g离心2-3分钟收集细菌，尽量吸弃全部上清。
2、向留有菌体沉淀的离心管中加入12ml Buffer P1(请先检查是否已加入RNase A)，使用移液器或涡旋振荡器充分混匀，悬浮细菌沉淀。
注意：如果菌块未彻底混匀，将会影响裂解效果，使提取量和纯度偏低。
3、向离心管中加入12ml Buffer P2，温和地上下颠倒混匀8-10次，使菌体充分裂解，室温放置3-5分钟。此时溶液应变得清亮粘稠。
注意：温和混匀，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。如果溶液未变得清亮，提示可能菌量过大，裂解不彻底，应减少菌体量。
4、向离心管中加入12ml Buffer E3，立即上下颠倒混匀8-10次，此时出现白色絮状沉淀，室温放置5分钟。12000×g离心10分钟，将上清全部倒入除内毒素过滤器中，慢慢推动推柄(Plungers)过滤，滤液收集在干净的50ml离心管(自备)中。
注意：Buffer E3 加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。
5、向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀。
注意：加入异丙醇过多容易导致RNA污染。
6、柱平衡：向已装入收集管中的吸附柱中加入2ml Buffer PS，12000×g离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
7、将步骤5中滤液与异丙醇的混合溶液转移到平衡好的吸附柱(已装入收集管)中。
8、6000-12000×g离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
注意：吸附柱的最大容积为15ml，所以第7步中所得溶液分多次过柱。如果离心机转子倾角较大时，建议加入吸附柱的溶液体积不超过10ml，以防发生漏液现象。
9、向吸附柱中加入10ml Buffer PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，6000-12000×g离心2分钟，倒掉收集管中的废液。
10、重复步骤9。
11、将吸附柱重新放回收集管中，12000×g离心5分钟，倒掉废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干吸附柱中残余的漂洗液。
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。
12、将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附膜的中间部位加入1-3ml Endo-Free BufferEB，室温放置2-5分钟，12000×g离心5分钟，将质粒溶液收集到离心管中。-20℃保存质粒。
注意：
1)为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，室温放置2-5分钟，12000×g离心5分钟，将质粒溶液收集到离心管中。
2)质粒拷贝数较低或>10 kb时，Endo-Free Buffer EB在65－70℃水浴预热，可以增加提取效率。

储存条件：室温(15～30℃)

北京百莱博科技有限公司是核酸扩增(PCR)产品的专业生产供应销*(代"售")商，恭候您的咨询选购北京一步法Real-Time RT-qPCR试剂盒(低含量ROX校正染料)品牌。