一步法RT-qPCR试剂盒（探针法）

产品信息

产品名称	产品编号	规格
Genmfast One Step Probe RT-qPCR Kit	SR31051	50 RXN (20 μL/RXN)
Genmfast One Step Probe RT-qPCR Kit	SR31052	200 RXN (20 μL/RXN)

产品描述
Genmfast One Step Probe RT-qPCR Kit是采用探针法进行 RT-qPCR反应的通用款试剂盒。本试剂盒以RNA为模板，使用基因特异引物，逆转录和PCR应可在同一管内连续进行，不需要额外的开管、移液等操作，简化了实验操作，降低了污染的风险。本反应体系可以对扩增产物进行实时检测，大大提高了检测灵敏度，并且省略了PCR反应后的电泳步骤，非常适合于RNA病毒等微量RNA的检测。
本试剂盒以RNA为模板，使用基因特异性引物，利用新型耐热Reverse Transcriptase 高效合成第一链cDNA，并搭配使用探针和高效 HotStart Taq DNA Polymerase，配合经过优化的缓冲体系，具有高扩增效率和高扩增灵敏性，能稳定高效的进行一步法RT-qPCR反应。
产品组分

组分	50 RXN (20 μL/RXN)	200RXN (20 μL/RXN)
2x One Step RT-qPCR Buffer	500 μL	2×1 mL
One Step Enzyme mix	100 μL	400 μL
50 X High ROX	20 μL	80 μL
50 X Low ROX	20 μL	80 μL
ddH2O(Nuclease Free)	500 μL	2×1 mL

适用机型
High Rox 适用机型：ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™
Low Rox 适用机型：ABI 7500, 7500 Fast, ViiA™7, QuantStudio™ 3 and 5, QuantStudio™ 6,7,12k Flex
Stratagene MX3000P™, MX3005P™, MX4000P™
不需要 Rox 校正的仪器型号：
Bio-Rad CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ™5, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon ®, Opticon ®2, Chromo4™ Eppendorf Mastercycler® ep realplex, realplex 2 s; Qiagen Corbett Rotor-Gene® Q, Rotor-Gene® 3000, Rotor-Gene® 6000 Roche Applied Science LightCycler® 480, LightCycler® 2.0; Lightcycler® 96 Thermo Scientific PikoReal Cycler; Cepheid SmartCycler®; Illumina Eco qPCR
运输和保存方法
冰袋运输。-20℃避光保存，有效期 1 年。本品避免反复冻融。建议分装保存。
注意事项
1. 使用 2xOne Step RT-qPCR Buffer 时，请充分融解，混匀后使用，避免强光直射。若同时需要配制多个 One Step RT-qPCR 反应时，应配制各种试剂的混合液，然后再分装到每个反应管，减少试剂损失。
2. 试剂盒中的 One Step Enzyme mix含有高浓度甘油，在使用前请轻轻混匀，避免起泡；分取之前请瞬时离心收集到管底后使用，使用后立即放回-20℃冰箱保存。
3. 反应液的配制和分装一定使用无污染的枪头、Microtube，尽量避免污染。
4. 为保证反应的成功，建议使用高质量的RNA模板。
5. 本试剂盒只能使用特异性引物，不能使用随机引物或Oligo dT引物等进行反转录反应。
6. 一步法 RT-qPCR 实验设计用于扩增的引物时，推荐扩增产物长度在70~200 bp，效果最佳。
操作说明
实验准备：
l 1.5 mL RNase-free EP 管、RNase-free PCR 管、移液器和枪头、冰盒或冰。
l PCR 探针、引物与模板。
l 荧光定量 PCR 专用管或平板。
实验方法：
用户需自备的试剂：RNA 模板、引物、探针。请按照不同品牌
荧光定量 PCR 仪的使用说明书要求进行实验操作。
1. 配制 One Step RT-qPCR 反应体系：
推荐冰上配制反应体系，以 20μL 反应体系为例：

组分	加入体积	加入体积
2x One Step RT-qPCR Buffer	10 μL	25 μL
One Step Enzyme mix	2 μL	5 μL
正向引物(10 μM) *	0.4 μL	1 μL
反向引物(10 μM)	0.4 μL	1 μL
TaqMan Probe (10 μM)	0.4 μL	1 μL
50×High Rox or Low Rox	0.4 μL	1 μL
模板 RNA	Total RNA: 1 pg-1 µg	Total RNA: 1 pg-1 µg
ddH2O(Nuclease Free)	to 20 μL	to 50 μL

【注】: a 所有试剂使用前应充分混匀。
b 引物浓度：通常引物终浓度为 0.2 μM，也可以根据情况在 0.1-1.0 μM 之间进行调整。
c 探针浓度：探针终浓度可在 50 nM-250 nM 之间调整。
d 模板稀释：建议在20μL的体系中加入10 pg~100 ng的Total RNA为模板。

2. 推荐的 One Step RT-qPCR 反应程序：

	反应阶段	温度	时间	循环数
1	逆转录	50℃	10 min	1
2	预变性	95℃	3 min	1
3	循环反应	95℃	10 sec	42
		60℃	30~40 sec

【注】: a 对于含复杂二级结构或高 GC含量的 RNA 模板，可将逆转录温度提高到 55℃，有助于提升扩增效率和灵敏度。
b 逆转录时间可以根据模板的复杂程度进行调整，时间为 10 min 时可满足大多数基因的鉴定。
c 不同的qPCR 检测仪器所需的荧光信号采集时间不同，请根据最短时间限制进行设置。