【注】: a 所有试剂使用前应充分混匀。 b引物浓度:通常引物终浓度为 0.2 μM,也可以根据情况在 0.1-1.0 μM 之间进行调整。 c探针浓度:探针终浓度可在 50 nM-250 nM 之间调整。 d 模板稀释:建议在20μL的体系中加入10 pg~100 ng的Total RNA为模板。
2. 推荐的 One Step RT-qPCR 反应程序:
反应阶段
温度
时间
循环数
1
逆转录
50℃
10 min
1
2
预变性
95℃
3 min
1
3
循环反应
95℃
10 sec
42
60℃
30~40 sec
【注】: a 对于含复杂二级结构或高 GC含量的 RNA 模板,可将逆转录温度提高到 55℃,有助于提升扩增效率和灵敏度。 b 逆转录时间可以根据模板的复杂程度进行调整,时间为 10 min 时可满足大多数基因的鉴定。 c 不同的qPCR 检测仪器所需的荧光信号采集时间不同,请根据最短时间限制进行设置。