北京现货BAmp DNA Polymerase销售

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名称：北京现货BAmp DNA Polymerase销*(代"售")
编号：WE0105
规格：500U
产地：国产|进口
  BAmp DNA Polymerase在具有5"-3"DNA聚合酶活性的同时具有3"-5"外切酶活性，是一种兼具高扩增效率和高保真性的耐热聚合酶。其主要特点是可以高效扩增长片段DNA，尤其在扩增>10 kb的DNA片段方面，其优势更加明显，所扩增的片段最长可以达到40 kb。该酶具有高度的延伸和校对能力，保真度高于普通Taq酶。优化的缓冲体系使酶的应用更加广泛，即使以复杂的基因组DNA为模板，也可以保证很高的特异性和长片段的扩增。特有的PCR增强剂(C-Solution)使GC含量高，有二级结构和重复序列的复杂模板也能得到高效扩增。使用本制品扩增得到的PCR产物的3"端附有一个“A”碱基，因此可直接用于T/A克隆。适用于高保真度的长片段PCR扩增和复杂模板的PCR扩增，如构建基因图谱、序列测定及分子遗传学研究等。

产品组成：

 

组份	500U
BAmp DNA Polymerase, 5 U/μl	100μl
10×PCR Buffer	1.8ml
5×C-Solution(PCR Enhancer)	1.8ml

注意：本产品的10×PCR Buffer中含有15 mM*离子。

活性定义：
用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，在74℃，30分钟内，将10 nmol脱氧核苷酸掺入到酸性不溶物质所需的酶量定义为1个活性单位(U)。

质量控制：
1、经过多次柱纯化，SDS-PAGE检测其纯度大于99%；
2、经检测无外源核酸酶活性；
3、PCR方法检测无宿主残余DNA；
4、能有效地扩增人基因组中的单拷贝基因；
5、室温存放一个月，无明显活性改变。

使用方法：
以下举例为以人基因组DNA为模板，扩增1 kb的片段的PCR反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小不同进行相应的改进和优化。

1、PCR反应体系

试剂	50μl反应体系	终浓度
10×PCR Buffer	5μl	1×
dNTP Mix，10 mM each	1μl	200μM each
Forward Primer，10μM	2μl	0.4μM
Reverse Primer，10μM	2μl	0.4μM
Template DNA	<0.5μg	<0.5μg/50μl
BAmp DNA Polymerase, 5 U/μl	0.5μl	2.5 U/50μl
5×C-Solution	10μl	1×
ddH2O up to	50μl

注意：
1)引物浓度请以终浓度0.1-1.0μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。
2)当利用常规条件仍然未能得到扩增时，可以加入5×C-Solution(PCR Enhancer)，PCR增强剂可以使富含GC，有二级结构和重复序列的复杂模板到高效扩增，可以提高反应的特异性。但PCR增强剂也有可能使常规条件成功扩增的反应扩增失败，因此第一次使用PCR增强剂时建议设置一个不加PCR增强剂的对照。

2、PCR反应条件

步骤	温度	时间	循环数
预变性	94℃	2 min
变性	94℃	30 s	25-35 个循环
退火	55-65℃	30 s
延伸	72℃	30 s
终延伸	72℃	5 min

注意：
1)一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，无法得到理想的扩增效率时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。
2)延伸时间应根据所扩增片段大小设定，BAmp DNA Polymerase的扩增效率为2 kb/min。
3)可根据扩增产物的下游应用设定循环数。如果循环次数太少，扩增量不足；如果循环次数太多，错配机率会增加，非特异性背景严重。所以在保证产物得率的前提下应尽量减少循环次数。

储存条件：-20℃，避免反复冻融。

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·BL21(DE3)感受态细胞
编号：WE0253
英文名称：BL21(DE3)Competent Cell
规格：100μl×10支
  本产品是大肠杆菌BL21(DE3)菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的热击转化。BL21(DE3)菌株适合表达非毒性蛋白，该菌株是以T7 RNA聚合酶为表达系统的外源基因蛋白高效表达的宿主。T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子调控，该区整合在BL21染色体上。使用pUC19质粒检测，转化效率可达107。

产品组成：

组份	0.1ml×10支
BL21(DE3)Competen t Cell	10×100μl
Control DNA pUC19，0.1ng/μl	10μl

实验前准备及重要注意事项
1、感受态细胞一定要用干冰运输。感受态细胞应在-80℃下保存，不可反复冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞的转化效率。
2、转化所有步骤均在无菌条件下操作。
3、包装中有0.1ng/μl的pUC19DNA，供对照试验使用。

使用方法：
1、取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100μl，可以根据实际情况分装使用。以下实验以50μl感受态细胞为例。
2、待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中加入目的DNA(根据实际情况加入适量的DNA，通常100μl感受态细胞能够被1ng超螺旋质粒DNA所饱和)，用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30分钟。
3、42℃热击45秒，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。
4、向每个离心管中加入450μl无菌的SOC或LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床，150 rpm振荡培养45分钟使菌体复苏。
5、根据实验需求，取适量已转化的感受态细胞，加到含相应抗生素的SOC或LB固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃直至液体被吸收，倒置培养，37℃培养12-16小时。
注意：
1)涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA总量较多，可取少量转化产物涂布平板；若转化的DNA总量较少，可取200-300μl转化产物涂布平板。若预计的克隆数较少，可通过离心(4000rpm，2分钟)后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于平板中。
2)新制备的固体培养基不易涂干，可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养。
3)涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。

储存条件：-80℃。


北京现货BAmp DNA Polymerase销*(代"售")关键词：BAmp DNA Polymerase,WE0105


·高效cDNA第一链合成试剂盒
编号：WE0131
英文名称：MMLV cDNA Synthesis Kit
规格：100次
  本试剂盒是专为两步法RT-PCR第一步实验配制的cDNA第一链合成试剂盒。本产品包含从RNA模板逆转录成cDNA第一链所需的所有试剂，其中包括MMLV逆转录酶、反应缓冲液、引物、dNTP等。经过突变改造的MMLV逆转录酶RNase H活性缺失，减少了逆转录反应中RNA的降解，更容易获得全长的cDNA。MMLV逆转录酶热稳定性强，可得高产量的cDNA，使用简单方便。本系统对后续的PCR以及定量PCR试验兼容性高，适用各种PCR反应的DNA聚合酶。

试剂盒组成：

组份	100次
MMLV，200 U/μl	100μl
5×RT Buffer	500μl
Primer Mix	240μl
dNTP Mix，2.5 mM Each	500μl
DTT，0.1 M	240μl
RNase-Free Water	1ml

产品特点
1、RNase H-：经突变的MMLV逆转录酶，RNase H活性缺失，更易获得全长cDNA。
2、使用方便：试剂盒包含除RNA模板外的逆转录所需全部试剂。

注意事项：
1、在操作过程中应避免RNase污染，防止RNA降解或实验中的交叉污染，建议在专门的区域进行RNA操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并经常更换手套。
2、实验尽量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，应使用0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理12小时，并在120℃下高压灭菌30分钟后使用，或者将玻璃器皿在180℃下干热灭菌60分钟后使用。实验中用到的无菌水应使用0.1%的DEPC处理后进行高压灭菌。
3、本试剂盒中的所有试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。所涉及的酶类使用后应尽快放回-20℃，避免反复冻融。
4、若起始RNA的量小于50ng，建议加入RNA酶抑制剂(RNasin)。本试剂盒并未提供，如需要可单独向本公司订购，货号：WE0223。

操作步骤：
注意：10ng-5μg总RNA可建立20μl反应体系，如果总RNA量大于5μg，请按比例扩大反应体系。

I．逆转录操作步骤：
1、将RNA模板、引物、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、MMLV和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
2、根据以下表格配制反应体系，总体积为20μl。
 

试剂	20μl反应体系	终浓度
dNTP Mix，2.5 mM Each	4μl	500μM Each
Primer Mix	2μl
RNA Template	Xμl	1ng-5μg
5×RT Buffer	4μl	1×
DTT，0.1 M	2μl	10 mM
MMLV，200 U/μl	1μl
RNase-Free Water	up to 20μl

注意：
1)若起始RNA的量小于50ng，则建议加入RNA酶抑制剂(RNasin)。本试剂盒并未提供，如需要可单独向本公司订购，货号：WE0223。
2)Primer Mix由Oligo(dT)和Random Primer配制而成。

3、涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
4、42℃孵育30-50分钟，85℃孵育5分钟。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
5、逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应，或置于-20℃长期保存。

II．若逆转录效率低，或RNA模板二级结构复杂、GC含量高时，建议采用以下步骤：
1、将RNA模板、引物、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、MMLV和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
2、根据以下表格配制反应体系，总体积为13μl 。
 

试剂	20μl反应体系	终浓度
dNTP Mix，2.5 mM Each	4μl	500μM Each
Primer Mix	2μl
RNA Template	Xμl	1ng-5μg
RNase-Free Water	up to 13μl

3、70℃孵育10分钟，迅速冰浴2分钟。
4、短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
5、继续向以上反应液中加入以下试剂：
 

试剂	20μl反应体系	终浓度
5×RT Buffer	4μl	1×
DTT，0.1 M	2μl	10 mM
MMLV(200U/μl)	1μl

注意：
1)若起始RNA的量小于50ng，则建议加入RNA酶抑制剂(RNasin)。本试剂盒并未提供，如需要可单独向本公司订购，货号：WE0223。
2)Primer Mix由Oligo(dT)和Random primer配制而成。

6、轻轻吹打混匀，42℃孵育50分钟，85℃孵育5分钟。
7、反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
8、逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应，或置于-20℃长期保存。

储存条件：-20℃，避免反复冻融。


北京现货BAmp DNA Polymerase销*(代"售")关键词：BAmp DNA Polymerase,WE0105

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