【产品概述】
本产品是专为两步法RT-PCR第一步实验设计的高灵敏度RT-PCR反应系统,可以从极低量的总RNA或poly(A) mRNA合成第一链cDNA,并能够通读GC含量高、二级结构复杂的RNA模板。该试剂盒使用重组表达的StarScript II M-MuLV Reverse Transcriptase (RTase),通过多点定点突变去除了RNase H的活性 (RNase H
-),并增加了该酶与模板-引物之间的亲和力,具有更好的热稳定性,因此其DNA聚合酶的活性和持续合成能力均高于野生型的M-MuLV RTase,合成的cDNA产量更高,长度可达15 kb。本试剂盒含有第一链cDNA合成所需的全部试剂,使用方便,对后续的PCR或定量PCR实验兼容性好,适合于各种耐热DNA聚合酶。
【产品组分】
StarScript II RTase (200 U/μl) |
20 μl |
5×RTase buffer* |
120 μl |
RNase Inhibitor |
12 μl |
Oligo (dT)18 (50 μM) |
20 μl |
Random Primer (50 μM) |
20 μl |
10 mMdNTP Mix |
30 μl |
DEPC-ddH2O |
1 ml |
【
保存条件】
-20℃恒温保存一年
【活性定义】
以poly(rA)为模板,oligo(dT)为引物,在37℃条件下,10分钟内催化1 nmol 的dTTP所需要的酶量定义为一个活性单位(U)。
【注意事项】
1. 实验过程中请注意避免RNase污染。
2. 除酶以外的各种试剂,使用之前请完全溶解并充分混匀,以防因盐离子浓度不均影响实验结果。
3. RNA模板的完整性对cDNA合成效率起着决定性作用,因此请选择可靠的RNA提取/纯化方法。建议使用GenStar TRIGene总RNA提取试剂 (货号P118-01) 制备高质量的RNA模板,并设置反转录反应阳性对照。
4. 由于所有的RNA提取方法都不能完全去除基因组DNA,所以应根据后续实验的需求,选择是否需要在反转录反应前去除残留基因组DNA。RNase-free DNase I (货号A216-01) 处理的具体方法见本说明书附录。
5. StarScript II RTase以RNA为模板获得全长的第一链cDNA,其起始位点由所用引物所决定:
1) 随机引物 (Random Primer) 在RNA模板上没有特异性结合位点,所有RNA都可以做为第一链cDNA合成的模板;
2) Oligo dT Primer只能以poly(A) mRNA作为cDNA合成的模板;
3) 采用序列特异性引物 (Gene Specific Primer) 以其结合位点为起始位点。
6. StarScript II RTase合成的第一链cDNA产物可直接加入PCR反应混合物中进行扩增,但加入体积不应超过PCR反应总体系的10%,否则影响目的片段的产量。PCR扩增使用的耐热DNA聚合酶和热循环条件需要根据目的片段的大小、GC含量、引物特性、以及对保真度的要求等进行选择。
7. 第一链cDNA合成产物经过处理后可作为第二链合成的模板,合成含各种标记的cDNA,作为杂交实验的探针。
8. RNA可置于-70℃以下长期保存,cDNA合成产物可置于-20℃保存。