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- 2026年08月03日
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文献和实验CRISPR 是一种基因编辑技术，由 Cas 核酸酶和 sgRNA 组成，可以对生物的 DNA 序列进行定向切割、修改，被 Nature 杂志列为 2013 年年度十大科技进展之一。 而将 CRISPR 与荧光成像结合，就可以建立一个活体成像系统，实现对特定基因位点标记成像，并进一步在基因的生物学功能研究中发挥着重要的作用。 在活细胞中实时监测内源基因活性对于研究基因的生物学功能并调控其表达水平至关重要。近年来越来越多证据表明，低表达基因虽然表达量较低，但是在各种生物学过程中
类似物的瞬时表达方式。miRNA的过表达载体中有插入成熟miRNA、pre-miRNA及pri-miRNA序列三种形式。其中pri-miRNA（含侧翼序列）的方式由于保留了每个microRNA独自的原始天然双臂结构，效果更好，是应用最为广泛的方法。microRNA过表达系统中有CMV启动子（II型启动子）和H1启动子（III型启动子）两种方式供选择。III型启动子（H1、U6等）具有表达效率高、有效的确定终止位置等优点，成为首选。II型启动子适用于pri-miRNA序列中有连续的5个T-导致III
（如某些原代细胞）。 无标记：适合短期池化实验，但无法富集。 2. 启动子 gRNA 一般用 U6 启动子（Pol III）。要注意 U6 对连续 T 敏感（poly-T 会导致转录提前终止），这也是 gRNA 设计时的禁忌之一。 Cas9 常用 EF1α、CMV、CAG 等。CMV 在某些细胞系（尤其是小鼠细胞和一些原代细胞）中容易沉默，长期实验建议选 EF1α 或 CAG。 3. 滴度：物理滴度 ≠ 功能滴度 这是最重要的一个坑。 物理滴度：p24 ELISA 或 qPCR 测基因组拷贝
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