病毒在神经系统中的应用

神经科学研究

病毒载体简介和特性

病毒载体是分子生物学家常用的、能将遗传物质导入细胞中的工具，可以在体内或者体外应用。病毒已经进化出专门的分子机制，从而能有效地将它们的遗传物质导入到被感染的细胞内。

分子生物学家第一次利用这种机制是在二十世纪七十年代，Paul Berg使用了含λ噬菌体DNA、且经过改造的SV40病毒感染猴子肾脏的培养细胞。现在，病毒载体广泛应用于各个领域的基础研究、精准的基因治疗、疫苗的开发等。

病毒载体的特点

1. 安全性：虽然有些病毒载体来源于致病性病毒，但是目前使用的病毒载体都经过改造，尽可能地降低危害增加安全性。通常的改造方法是删除病毒基因组中对于病毒复制至关重要的部分，这样病毒可以有效地感染细胞，但是如果要复制产生新的病毒，则需要提供被删除的部分；

2. 毒性低：在使用病毒载体时，病毒对于被感染细胞的生理功能的影响很小；

3. 稳定性：有一些病毒，它们的基因组不稳定，能迅速发生重组，这对于实验的可预料性和可重复性很不利，因此要尽可能地避免使用这类病毒；

4. 标记基因：病毒载体中一般包含几个特殊的基因，这几个基因能帮助确认哪些细胞被病毒感染，此类基因被称为标记基因。

病毒载体的基本要素

载体主要有病毒和非病毒两大类，其中质粒是一种新的非病毒转基因载体。不同的载体具备的元件可能不同，但都有一些共同的元件。

1. 复制起始位点：原核生物DNA分子中只有一个复制起始点，而真核生物DNA分子有多个复制起位点；

2. 抗性基因：便于筛选，如氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性等；

3. 多克隆位点：含有多个限制酶切位点，便于携带外源基因片段。

病毒载体在神经系统中的应用

在神经系统的研究中，比较常用的病毒有腺病毒、慢病毒、逆转录病毒和腺相关病毒，这四种病毒载体的基本特性如表一所示。

由于腺病毒免疫反应比较强，并且表达持续时间比较短（一般是7-10天），现在在神经系统中科学家较少使用腺病毒载体。

慢病毒可以实现高效的体外（in vitro）、体内（in vivo）感染，当有实验需要用同一个病毒同时进行体内、体外实验时，慢病毒是非常好的选择，而且慢病毒表达的起始时间很短（3-4天）、表达持续时间也比较长。由于逆转录病毒载体只感染分裂细胞，并且表达持续时间也比较长，因此被广泛应用于神经干细胞的研究。

而AAV载体由于整合方式安全（低频整合到“安全”位点）、滴度超高和表达持续时间非常长，特别适合于体内研究。神经系统中病毒载体应用参考信息如表二所示。

神经系统的基因功能研究策略

在神经系统中进行基因功能研究时，主要的策略有以下几种：

1. 质粒转染：即将质粒直接转入神经细胞内。对于体内的神经细胞，使用的方法有胚胎电转、iontoporation；

而对于体外培养的神经细胞，使用的方法有电转、钙转、脂质体转染（如lipofectamine 2000）等。

2. 转基因动物：转基因动物的优点在于基因操作的结果稳定可靠，而转基因动物的缺点在于成本高、动物的交配饲养耗时耗力、实验过程比较长，因此使得很多课题组不敢轻易进行尝试。

3. 病毒载体工具：病毒载体由于制作过程相对简单、成本低、基因能稳定长时间表达等优点而得到了广泛应用。

4. 转基因动物结合病毒载体工具：例如使用Cre-loxP系统进行基因敲除操作时，可以将Cre病毒通过立体定位注射的方式注射到loxP动物脑内，从而实现非常精准的区域和组织特异性。

如果使用Cre-loxP系统进行基因表达，可以将loxp病毒注射入Cre小鼠中，由组织特异性启动子驱动基因表达。CRISPR/Cas9作为当今最“火热”的基因组编辑技术，也可以通过病毒和转基因动物结合的方式进行操作。

在2014年，MIT的张锋实验室成功制作出Cre-dependent Rosa26 Cas9 Knockin小鼠（简称Cas9小鼠），从而可以将Cas9小鼠和 病毒结合，能非常方便地实现在特定区域内的某一种类细胞中同时敲除多个基因的目的（如图3A），也可以将Cas9小鼠和Cre小鼠交配，然后注射sgRNA实现基因组编辑目的（如图3B）。