多克隆抗体制备服务

多抗一般制备流程：完全抗原的准备→兔子的免疫→ 效价检测和终放→抗体亲和纯化→抗体的浓缩和保存。

具体实验步骤如下：

1.兔子的准备
挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只（约2Kg），使其适应新的生活环境，至少稳定几天再进行首次取血.
预采血（作阴性参照用）
1.1 将兔子小心的放入固定的架中,使兔子平静；
1.2 小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见(也可不剃)；
1.3 如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位,使血管膨胀；
1.4 用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(约5ml血清)；
1.5 小心抽出针头,适当按压伤口以免流血,然后用酒精棉球消毒伤口；
1.6 将收集的血液置于37`C灭活30min,最后置于4`C过夜使其凝结释放血清；
1.7 将凝结好的血液在10000r／min离心10min； h.收集上清，即为血清。

2. 兔子的免疫
2.1 注射两只兔子的抗原为1ml,抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂.每只兔子初次免疫400ug抗原比较适合,也可适当减少以获得更好的结果，后续免疫每次为100ug即可。
2.2 将1ml的佛氏完全佐剂与准备好的1ml抗原充分混匀,呈乳白色；
2.3 小心从笼中取出兔子，每只兔子免疫4个部位(背部和大腿根部均可),每个部位250ul,针头呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留数秒以防止抗原外流。
2.4 免疫周期为20天,免疫完后7-10天取血(包括中途测试取血和最终放血),总共免疫4-5次。

3.效价检测
3.1 2个参照:阴性参照为预取血血清，均以1抗起始浓度稀释(封闭稀释液);阳性参照为以前阳性血清
3.2 于96孔板中每孔滴加100ul，1ug/ml抗原，于4℃过夜，也可以37℃孵育2小时。
3.3 倒掉抗原溶液，每孔加入200ul的封闭液，4℃过夜或者37℃孵育2小时。
3.4 倒去封闭液，在吸水纸上拍打尽量吸干残留液体,用洗涤液洗板三次,每次尽量拍干残留液体,若要放置一段时间, 37℃烘干并用封口袋封好于-20℃存放。
3.5 取包被好的96孔板，第一孔加入阴性参照液100ul，第二孔加入阳性参照液100ul，第三孔加入1:500的待测抗血清，后续各孔在此基础上倍比稀释，于37℃孵育1 小时。
3.6 倒掉液体，用洗涤液洗板三次，拍干。每孔加入100ul的HRP标记的小鼠抗兔IgG（1：2000稀释），于37℃孵育45分钟。
3.7 倒掉液体，用洗涤液洗板三次，拍干。每孔加入100ul的TMB底物（Sigma 单组份TMB ）37℃孵育5—20分钟(根据颜色深浅来决定显色的时间)。
3.8 每孔加入50ul的终止液（2N H._2.S.O._4.），在酶标仪上读取波长450nm处的吸光值。

抗体效价检测达到100万以上后可以对兔子进行终放血。抗体的纯化

4.抗体的亲和---亲和柱的制备
4.1 称取1mg CNBr-Sepherose 4B的琼脂糖凝胶加入2mmol／L的盐酸中，4`C过夜使其充分溶涨，可获得3ml溶涨胶。
4.2 将凝胶转移入纯化柱中，用约20ml 2mmol／L的盐酸洗介质3次。
4.3 用偶联缓冲液洗介质一次，因为活化基团在偶联缓冲液PH值下易水解，所以此步骤最好在几分钟内完成。
4.4 将溶解在5ml偶联缓冲液中的5-10mg的抗原加入凝胶中
4.5 室温下轻轻混合摇动2-4小时，或4`C过夜，如需测定结合效率此步骤结束后取少量溶液待测。用20ml的偶联缓冲液洗介质一次。
4.6 加入15m l 1% BSA 溶液室温下孵育2小时或4`C过夜。
4.7 用磷酸盐缓冲液洗涤介质3次以上，每次15ml以上 h.
4.8 抗原固相化完成，可用于纯化。
4.9 若不立即使用或者使用后，用20%的乙醇封存。

5.抗血清的纯化和保存
5.1 抗血清用PBS等体积稀释，5000-10000r／min离心15分钟，取上清.
5.2 用10倍体积的PBS清洗抗原亲和柱以平衡柱子。
5.3 将稀释好的抗血清10ml加入平衡好的柱子中。
5.4 室温下轻轻混合摇动2-4小时，或4`C过夜
5.5 用10倍体积的PBS清洗抗原柱，以洗去结合在柱子上的杂蛋白
5.6 用2倍体积的抗体洗脱液洗涤柱子，以得到特异性抗体
5.7 用10倍体积PBS平衡柱子
5.8 用20%的酒精封存柱子，4`C保存。

在得到洗脱的抗体后，经蔗糖或聚乙二醇浓缩后于PBS中透析除盐，使用紫外可见分光光度计在波长280nm处测定抗体OD值，所得OD值除以1.35即为所测抗体的浓度，添加40-50%甘油置于-20`C可长期保存。

晶莱生物服务流程


晶莱生物实验服务项目

动物实验	细胞生物学	病理实验
消化系统模型	细胞培养	病理染色
胃酸分泌模型	普通细胞株	HE染色
脓毒症模型	细胞缺氧培养	油红O染色
胃溃疡模型	细胞培养+支架	番红固绿染色
胰腺炎模型	干细胞培养	Masson染色
肝纤维化模型	原代细胞分离/提取/培养	天狼猩红染色
DIO肥胖模型	细胞转染/病毒感染	PAS糖原染色
胆结石模型	Trans well共培养	阿利新蓝染色
结肠炎(UC)模型	细胞增殖	甲苯胺蓝染色
脂肪肝模型	细胞计数	尼氏染色
急性肝损伤模型	生长曲线测定	LFB髓鞘染色
免疫、代谢系统疾病模型	存活曲线测定	普鲁士蓝染色
骨质疏松模型	ccK-8增殖检测	VG染色
糖尿病模型	MTT增殖检测	EVG染色
高尿酸血症模型	CFSE检测增殖-流式检测	VonKossa染色
呼吸系统模型	BrDU检测-免疫荧光法	刚果红染色
肺纤维化模型	细胞凋亡	苏丹黑B染色
慢性肺阻塞模型	Annexin V/PI流式检测细胞凋亡	Trap染色
急性肺损伤模型	WB检测凋亡相关蛋白	抗酸染色
哮喘模型	透射电镜观察凋亡小体	革兰氏染色
肺栓塞模型	Tunel染色(POD法,DAB显色)	AB-PAS染色
支气管炎模型	Tunel(荧光法,含试剂盒)	亚甲基蓝染色
泌尿生殖系统模型	DNA ladder法	苯胺蓝染色
慢性肾衰模型	细胞周期	荧光 DAPI染色
急性肾衰模型	细胞显微计数	普鲁士蓝染色
肾间质纤维化模型	PI染色	间苯二酚碱性品红染色
肾结石模型	BrdU渗入法	银染
肾炎模型	免疫荧光染色	黑色素染色
子宫内膜异位症模型	PI流式检测细胞周期	镀银染色
心血管系统模型	细胞运动	PASM 六胺银染色
冠心病模型	Transwell检测细胞迁移	VG染色
心肌梗死模型	Transwell检测细胞侵袭	富尔根染色
心脏骤停模型	细胞划痕	亚甲基蓝染色
慢性心力衰竭模型	细胞克隆	碘-碘化钾染色
动脉粥样硬化模型	集落形成法/稀释铺板方法	Goldner三色法染色
白血病模型	软琼脂克隆法	PAS-萘酚磺S染色
高血压模型	毛细管克隆法	改良苯酚品红染色
神经系统模型	体外实验血管生成	网状纤维染色
脑卒中模型	磁珠分选细胞	β-半乳糖苷酶染色
栓塞性脑梗死模型	流式分选细胞	镀银染色
脑出血模型	开机费	movat五色染色
脑损伤模型	单色	维多利亚蓝染色
脊髓损伤模型	双色	免疫组化
帕金森模型	CBA多细胞因子流式检测	免疫组化预式
老年痴呆模型	组织/血液细胞制备	免疫组化正式
应激模型	组织单细胞制备	免疫荧光（石蜡-单标）
骨骼疾病模型	中性粒细胞提取	免疫荧光（石蜡-双标）
骨折模型	其他样本细胞制备（如血液等）	免疫荧光（石蜡-三标）
骨缺损模型	外周血PBMC分离	免疫荧光（冰冻-单标）
风湿免疫性关节炎模型	线粒体组学	免疫荧光（冰冻-双标）
骨关节炎模型	线粒体膜电位检测-流式法	制片前处理
五官疾病模型	线粒体膜电位检测-免疫荧光法	石蜡组织包埋
眼科疾病模型	线粒体ROS生物含量检测--流式	特殊包埋（细胞、材料、眼球等）
鼻腔疾病模型	线粒体ROS生物含量检测--免疫荧光	软化（肝硬化、皮肤结痂、植物等）
皮肤疾病模型	线粒体通透性转换孔（mPTP）	骨组织脱钙（小）
皮肤损伤模型	溶酶体免疫荧光法	骨组织脱钙（大）
肿瘤疾病模型	线粒体+溶酶体共定位	骨组织EDTA脱钙（小）
原位瘤模型	内质网	骨组织EDTA脱钙（大）
转移瘤模型	线粒体钙瞬时变化检测-流式	石蜡白片
皮下植瘤模型	ATP检测	细胞爬片
	ADP检测
	AMP检测
流式	DNA/RNA半定量检测	基因编辑工具
组织细胞悬液处理	pcr检测mRNA	合成（3保1）片段/质粒/引物合成
细胞处理	microRNA检测	质粒载体构建
血液标本处理	LncRNA表达量的检测	过表达腺病毒载体构建包装
细胞刺激培养	CirRNA表达量的检测	shRNA腺病毒载体构建包装
单色检测	凝胶电泳	过表达慢病毒载体构建包装
双色检测	基因合成	shRNA慢病毒载体构建包装
Annexin V/PI凋亡	＜300	过表达腺相关病毒载体构建包装
细胞周期	300-1,500	shRNA腺病毒载体构建包装
	1500 - 5000	稳转细胞株
	>5000
	特殊序列
ELISA	WB	qPCR
组织匀浆处理	蛋白提取及定量一	RNA抽提
ELISA（不含试剂盒）48T/kit	WB检测一（10孔膜/指标）	mRNA引物设计及合成
ELISA（不含试剂盒）96T/kit	灰度值分析及作图一（10孔膜/指标）	miRNA引物设计及合成
ELISA（含国产试剂盒）48T/kit	蛋白提取及定量二	LncRNA引物设计及合成
ELISA（含国产试剂盒）96T/kit	WB检测二（10孔膜/指标）	CircRNA引物设计及合成
	灰度值分析及作图二（10孔膜/指标）	mRNA RT-qPCR
		miRNA RT-qPCR
		LncRNA RT-qPCR
		CircRNA RT-qPCR

收费标准/服务周期/提供结果：
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