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文献和实验一、TUNEL法的实验原理 细胞发生凋亡时, 染色体DNA双链或单链断裂产生大量的粘性3'-OH末端,可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。由于正常的或正在增殖
素与生物素高度特异性结合的关系来放大免疫组化信号,但此方法有产生内源性生物素背景的可能性。而酶标聚合物法,利用聚合物与二抗结合,形成聚合物-二抗复合物,实现信号放大,该方法不受内源性生物素的干扰。 表 2 免疫组化多种检测系统分类 图 2 酶标聚合物法检测系统 图 3 链霉亲和素-生物素法检测系统 在显色法中,针对 HRP(辣根过氧化物酶)显色系统,其常用底物为DAB/AEC(HRP/DAB 呈棕褐色染色,具有很好的光稳定性,HRP/AEC 呈红色染色,在阳光下会褪色,不易保存。 基础 IHC
用了许多方法检测小鼠的肝脏、脑部、睾丸等组织的细胞凋亡,其中 TUNEL 法做的最多,我购买的试剂盒主要是 roche、 promega 公司,结果大多数成功,偶尔也有失败,下面我把实验中的关键问题与大家共享一下,同时也希望能对初学者有所帮忙。 TUNEL 法的实验原理 基本原理:对不同组织切片先增加细胞膜通透性,然后让 rTDT 和生物标记的 dTUTP 进入细胞内,在 rTDT 的辅助下 dTUTP 与核断裂的 DNA 3』-OH 结合,再用 HRP 标记的链霉
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