HEPENGBIO裂解液X IV：精子细胞/裂解液产品说明书

western-blot实验方法

2 hrs，或4 ℃ 过夜。封闭完用TBST 冲洗5 sec。用吸水纸吸去残余液。 II 一抗孵育：按照一抗说明书的推荐比例稀释一抗，使用TBST 或封闭液稀释。在一容器中，将PVDF 膜浸没在抗体溶液里，室温下2 hrs 或4 ℃ 过夜，摇床缓慢摇匀。 III 一抗孵育完后，用TBST 室温下在摇床上洗3 次，每次10 min。 IV 二抗孵育：同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下摇床缓慢摇匀1 -2 hrs。 V 二抗孵育完后，用TBST 室温下在摇床上洗3 次，每次10 min

Western blot 实验过程与经验分享

蛋白浓度（BCA 法） ① 八个标准孔，按说明书先加 PBS，再加标准蛋白液 ② 目的孔，每孔加 18ulPBS+2ul 目的蛋白 ③ 按说明书配 BCA 工作液，每孔加 200ul ④ 37°放置半小时后测浓度 （4）计算上样量，设计上样顺序 上样体积：上样量/浓度 x 5/4 上样顺序：无处理，对照，处理；体积最好不要相差太大 经验总结： 如何提高蛋白浓度：首先当然是多培养点细胞，多提供点组织啦，其次可以少加点裂解液，裂解时间长点，尽量裂解

一篇搞定 IP、co-IP 实验

糖，建议进行 Pre-clear；如果使用磁珠，此步可忽略 抗 X 抗体的轻链（25 kD）和重链（50 kD） 更侧重于如何在实验上进行优化（见下文） *注意：总蛋白上样量过多也会造成 非特异性结合，建议上样量为 500 ug-1 mg。上样之前一定要先用 BCA 定个量！定个量！定个量！ pre-clear：上样前先用裂解液过一遍柱子，减少基质本身对蛋白的吸附 Output：在某些 co-IP 实验中，实验人员会把IP后的上清分别进行诱饵蛋白 X 和靶蛋白 Y 的 WB 检测