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        western-blot实验方法

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        16931

        1、试剂耗材的准备:

        (1)转膜缓冲液(48 mM Tris-HCl,39 mM 甘氨酸,0.037% SDS,20%甲醇):
        western-blot实验方法

        (2)10 × 丽春红染液:
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        (3)TBS 缓冲液:
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        (4)TBST 缓冲液(含20%Tween20 的TBS 缓冲液):
        western-blot实验方法

        (5)封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST 缓冲液):
        western-blot实验方法

        (6)一抗、二抗及抗体稀释液:参照说明书,以封闭液或TBST 进行稀释。

        (7)底物显色液

        ECL,4℃ 避光保存,现用现配。

        (8)显影液和定影液

        用水稀释10 - 20 倍于铝盒中,可多次使用。室温避光存放。


        2、实验步骤:

        (1)蛋白样品制备:用细胞裂解液抽提蛋白,并测蛋白浓度。

        (2)取1 mg 蛋白进行SDS-PAGE。

        (3)转膜:(转膜缓冲液4 ℃ 预冷备用,冷却装置于- 80 ℃ 冰箱冷冻备用)。

        (4)将2 张海绵垫、2 张滤纸、转膜夹子及玻棒浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。

        (5)戴上手套,剪一张与凝胶尺寸相近的PVDF 膜(83 mm × 75 mm),左上角剪一缺口作为标记,浸泡在盛有20 mL 甲醇的平皿中约15 sec,直到膜变半透明。用纯水冲洗膜2 次。浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。

        (6)SDS-PAGE 结束后,小心地剥下两块凝胶,一块用于考马斯亮兰染色观察电泳情况,另一块浸泡在转膜缓冲液中预平衡。海绵垫、滤纸、PVDF 膜及凝胶的预平衡时间在15 min - 1 hr 之间。

        (7)将转膜夹子打开,使黑的一面保持水平。按照海绵垫、滤纸、凝胶、膜、滤纸和海绵垫的先后顺序铺垫,制备凝胶转移夹层。将膜与凝胶对齐。用玻璃棒赶走气泡。

        (8)将夹子夹起来,扣紧,小心不要移动内层。放入电转槽中。使夹子的黑面对槽的黑面,夹子的白面对槽的红面。

        (9)将电转槽放在冰水盒中。将预冻的冷却装置放入槽内。 缓慢倒入约650 mL转膜缓冲液。

        (10)盖好盖子,接上电源。根据蛋白分子量来调节工作电流,一般使用100 V(350mA),转移60 - 90 min。

        (11)转膜结束后,断开电源,拆卸转膜夹子,逐一掀去各层。将膜用1 × 丽春红染色5 min,用水冲洗3 次,观察蛋白转印是否完全。同时也可将凝胶用考马斯亮蓝染色,胶上无蓝色条带则说明蛋白转印完全。

        (12)免疫反应:

        I 封闭:用镊子将膜移至含有25 mL 封闭液的平皿中,用脱色摇床室温缓慢摇匀2 hrs,或4 ℃ 过夜。封闭完用TBST 冲洗5 sec。用吸水纸吸去残余液。

        II 一抗孵育:按照一抗说明书的推荐比例稀释一抗,使用TBST 或封闭液稀释。在一容器中,将PVDF 膜浸没在抗体溶液里,室温下2 hrs 或4 ℃ 过夜,摇床缓慢摇匀。

        III 一抗孵育完后,用TBST 室温下在摇床上洗3 次,每次10 min。

        IV 二抗孵育:同上方法准备二抗稀释液并与膜接触,室温下摇床缓慢摇匀1 -2 hrs。

        V 二抗孵育完后,用TBST 室温下在摇床上洗3 次,每次10 min。

        (13)显影和定影:

        I 将ECL Plus 显色液的A 液和B 液在容器里体积混合,根据膜的大小来确定显色液的量,1 min 后,将膜与显色液充分接触。

        II 反应1 - 5 min 后,吸去膜上残余液,将膜转移至一干净保鲜膜上,包好,放入压片夹中。

        III 剪一张比膜尺寸稍大的X 光片,打开压片夹,将X 光片放在膜上,一旦放上,便不能移动。关上压片夹,开始计时。

        IV 根据信号强弱调整曝光时间,一般1 - 5 min,也可选择不同时间多次压片以达最佳效果。

        V 曝光结束后,打开压片夹,将X 光片迅速浸入备好的显影液中显影,待出现明显条带后,终止显影。一般1 - 2 min(20 - 25 ℃)。

        VI 显影结束后,用水冲洗X 光片,放到定影液中,定影时间一般为5 - 10 min,以胶片透明为止。

        VII 用水冲洗去底片上残留的定影液,室温下晾干。

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