植物叶绿体F型ATP酶（F type ATPase）活性比色

腺苷三磷酸酶，又称为ATP酶（adenosine triphosphatase；ATPase或ATP phosphohydrolase；EC3.6.1.3），属于磷酸水解酶，可以催化含磷的酸酐分解，即催化三磷酸腺苷分解为二磷酸腺苷和无机磷。ATP酶的去磷酸化反应释放出能量，成为细胞生命代谢的能源。ATP酶为跨膜蛋白（transmembrane），帮助传输各种代谢分子进出细胞。根据ATP酶的结构和功能，分为五类不同的ATP酶，即F、V、A、P和E型。P型，又称为E1E2 型，存在于细菌和真核细胞膜和细胞器上，其功能在于水解ATP获得能量，跨膜运输各种化学分子，包括Ca²⁺传输性、Na⁺-K⁺ /H⁺-K⁺传输性、H⁺传输性和所有细菌型等，其中胃氢/钾ATP酶，一种与胃酸分泌相关的质子泵，属于这一类型。V型，又称为V1V0型，主要存在于真核细胞的液泡（vacuole）中。A型，又称为A1A0型，存在于古生菌（archaea）中。E型，为细胞表面的酶。V型，又称为V1V0型，也称为氢V型ATP酶，主要存在于所有真核细胞的囊泡（vacuole或vesicle）中。F型ATP酶（F type ATPase），又称为ATP合成酶（ATP synthase）、F1F0 ATP酶（F1F0 ATPase）和线粒体呼吸链复合物V（complex V），主要在线粒体、叶绿体或细菌细胞膜上，进行氧化磷酸化或光合作用。其中叶绿体ATP合酶（chloroplast ATP synthase），又称为CF1F0ATP酶。F型ATP酶主要有两个结构域：F0为质子通道，由15亚体蛋白构成，包括I1II1III12IV1等；和F1催化活性结构域，由水溶性的α3β3γδε蛋白构成。其特征性的酶活性是寡霉素敏感的ATP合成酶。CF型ATP酶的主要功能在于通过跨膜质子梯度，形成光合成电子传导（photosynthetic electron transport），产生细胞所需的能量ATP。基于ATP，在寡霉素参与下，受到F型ATP酶的水解，进而通过bing酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），产生的吸光峰值的变化（340nm），来定量分析CF型ATP酶活性。其反应系统为：

产品内容

HEPENGBIO清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO缓冲液（Reagent C） 毫升
HEPENGBIO反应液（Reagent D） 毫升
HEPENGBIO阴性液（Reagent E） 毫升
HEPENGBIO底物液（Reagent F） 微升
HEPENGBIO专性液（Reagent G） 微升
产品说明书 1份

保存方式

保存HEPENGBIO清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；HEPENGBIO反应液（Reagent D），避免光照，有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器
1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器
DOUNCE匀浆器：用于裂解组织细胞
尼龙丝或60微米尼龙网：用于去除植物裂解残渣
小型漏斗：用于过滤的装置
微型台式离心机：用于样品制备
培养箱：用于反应孵育
比色皿：用于光谱分析的容器
分光光度仪：用于光谱分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；HEPENGBIO反应液（Reagent D）注意避光。然后进行下列操作。

• 样品准备

1. 准备好新鲜的植物叶片组织，并秤重以确定200毫克组织重量
2. （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
3. （选择步骤）加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4. 用刀片切碎组织（注意：建议去除叶茎）
5. 放进一个预冷的15毫升锥形离心管
6. 加入预冷的xx毫升HEPENGBIO裂解液（Reagent B）
7. 涡旋震荡5秒，充分混匀
8. 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器
9. 置于冰槽里用匀浆棒匀化组织（约80下）
10. （选择步骤）准备1个小型漏斗，内衬尼龙丝或60微米尼龙网，置于50毫升锥形离心管上
11. （选择步骤）将所有组织匀浆液移入到小型漏斗里过滤（注意：可以使用4层纱布替代）
12. 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为200g
13. 小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）
14. 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1000g
15. 小心抽去上清液，保留绿色沉淀颗粒，避免光照——
16. 加入xx微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B），充分混匀沉淀颗粒群
17. （选择步骤）进行叶绿素定量测定（建议使用