PV02-pTOPO-D1一步法定向原核表达试剂盒

PV02-pTOPO-D1一步法定向原核表达试剂盒

产品介绍：

本载体采用了世界先进的Directional Topoisomerase Cloning（定向拓扑异构酶克隆技术）可以在5分钟内将待表达目的基因（高保真酶扩增的平末端片段）一步法定向克隆到高效pET增强型载体，利用T7lac启动子进行严谨调控，高效表达。 
1. 简单快速，加入待表达基因片段室温仅需5分钟便可完成原核表达载体构建。
2. 定向克隆技术，超过90%插入为正确方向插入，减少克隆筛选耗费的时间。
3. T7lac启动子严谨调控本底表达，实现表达过程的可控和高效表达。
4. 氨苄抗性标记筛选，N端和C端6 ´ Histag标签方便表达后纯化。 
5. 带肠激酶(EK)酶切位点，可以方便将标签切除得到不带标签的蛋白。

测序可以采用 T7/T7 ter 通用引物测序（见后面图谱）

 试剂盒组成、储存、稳定性：

        －20℃储存，至少 6 个月内不影响使用效果。 

 操作步骤：
1. 待表达目的基因扩增引物设计原则：
(1) 为了达到定向克隆的目的，上游引物 5’端应该加上额外的 4 个碱基 CACC，这样 PCR 产物的 5’端可以和载体上突出的 GTGG 互补配对，从而达到定向克隆的目的。
举例：
待表达序列：5′-ATG GGA TCT GAT AAA ... 
设计上游引物：5′-CACC ATG GGA TCT GAT AAA ...
(2) 如仅需在 N 端加上 6  Histag 标签，则下游引物的起始端应该加上终止密码子（密码子序列应该为反向互补序列，例如终止密码子是 TGA，那么下游引物起始为 TCA）
(3) 如需在 N 端和 C 端同时加上 6  Histag 标签，则下游引物的起始端应该不包含终止密码子；为达到定向克隆的目的，下游引物 5’起始应该不包含 CACC，这样可以避免 PCR 产物的 3’端也可以和载体上突出的 GTGG 互补配对而造成错误方向的插入。
2. 连接反应的准备：
PCR引物不能磷酸化。使用扩增产物是平末端的高保真聚合酶系列扩增（如Pfu、Vent、Phusion DNA Polymerase）。 PCR产物（仅有目的条带、无非特异条带和引物二聚体）可直接进行连接反应，无需纯化，否则建议胶回收纯化（货号：DR01)。如果是以质粒为模板的PCR产物则最好进行纯化，因为模板质粒也可能长出菌落（但不是想构建的目的载体）。
3. 连接反应：
1) 室温（25℃-37℃）设立 10l 连接体系（建议用 0.2ml PCR 管，PCR 仪器控温）：

加完试剂后，用移液器轻轻吹打混匀或者轻弹管底混匀，低速瞬时离心收集所有液体在离心管底，注意此步骤不能在冰上进行，只能在室温（20℃-30℃）进行。不同大小插入片段的推荐用量： 

2) 室温（25℃-37℃）连接 5 分钟。
本载体推荐室温 5 分钟完成连接。长片段或者连接困难片段可以延长连接时间到15 分钟，温度可选 37℃，可显著增加转化子数量。
3) 连接产物可直接转化克隆感受态细胞（如 DH5a，TOP10 等）或贮存于-20℃。如尚未准备好感受态细胞，可以将连接产物短时间置于冰上备用。 

4. 转化：
1) 50-100l 感受态细胞，置于室温解冻，完全解冻后（约 1 分钟左右）轻掸几次将细胞均匀悬浮。
2) 加入 5l 连接液(最多可全部加入，只要体积不超过感受态细胞体积的 1/10)，轻轻混匀，室温放置 5 分钟。
根据我们的经验，本公司载体使用商品化的感受态细胞不需要冰浴和热休克、室温放置 5 分钟便可获得足够多转化子，如果实验室自制感受态细胞或者效率较低时，可以按照标准程序进行。
3) 加 300-500l LB 或者 SOC 培养基(不含抗生素)，37℃ 180 rpm 振荡培养 60 分钟。根据我们的经验，一般可以直接将培养基（事先平衡至室温） 加入感受态细胞的 1.5 ml 离心管，盖上离心管盖，水平固定在振荡培养箱中振荡培养复苏即可，不需要转移到试管培养复苏。
4) 取 200l 菌液涂板，培养过夜（如果预计转化子少，为得到较多克隆，4000 rpm 离心 1 min，吸弃掉部分上清，保留 100-150l，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板） 

5. 转化子的筛选鉴定： 
1). 菌落 PCR 检测/提取质粒内切酶酶切鉴定阳性克隆。
2). 用 T7 Promoter /T7 Terminator 通用引物测序，来确定是否含有目的克隆。
6. 目的基因表达： 
感受态细胞： BL21(DE3)表达感受态细胞系列均可用于表达。转化阳性克隆质粒于BL21(DE3)感受态细胞系列进行表达。如果表达毒性基因，建议选择 BL21(DE3)pLysS感受态细胞。
诱导：挑选单克隆，接种于 5ml LB/Amp+培养基中，37℃250rpm 培养，当 OD600=0.5至 0.8 时(推荐取值 0.6），加入终浓度为 0.5-1mM 的 IPTG 诱导表达。为了得到最大量表
达，建议试验不同的诱导时间。
验证纯化：表达结束后，收集菌体沉淀，经过 SDS-PAGE 跑胶染色检测蛋白的表达情况，HIS 标签蛋白可用镍柱亲和层析纯化。 

 pTOPO-D1 载体图谱：

 pTOPO-D1 载体多克隆位点序列：