酵母单杂交文库构建

酵母单杂交文库构建

 

 

▼服务简介

 

  酵母单杂交体系自1993年由Wang和Reed创立以来，在生物学研究领域中已经显示出巨大的威力。应用酵母单杂交体系已经验证了许多已知的DNA与蛋白质之间的相互作用，同时也发现了新的DNA与蛋白质的相互作用，并由此找到了多种新的转录因子。酵母单杂交技术是一种研究蛋白质和特定DNA序列相互作用的技术方法。

 

▼应用场景

 

  鉴别DNA结合位点，并发现潜在的结合蛋白基因，对DNA结合结构域进行分析。

 

▼实验原理

 

  真核生物基因的转录起始需转录因子参与，转录因子通常由DNA结合结构域(DNA—binding domain，BD)和转录激活结构域(activation domain，AD)。用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白是一种典型的转录因子，GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)，而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。在GAL4系统中构建与基因的ORFs融合的激活结构域GAL4-AD的特异载体，顺式作用元件与GAL4的DNA结合结构域GAL4-BD融合构建载体，分别转化酵母细胞。在酵母内表达的蛋白若与顺式作用元件发生相互作用时，就会将GAL4-BD和GAL4-AD结合在一起，从而与上游激活序列(upstream activating sequence, UAS)结合，激活相应报告基因的表达，在相应的营养缺陷型培养基上筛选阳性。

 

▼服务内容

 

 

▼案例展示

 

▼常见问题

 

  1.Clontech文库是否可行？

  clontech和invitrogen体系是两家公司的产品，分别用的是SMART和Gateway重组方法。判定文库质量有3个标准，库容，重组率，平均插入片段大小。clontech体系存在很多技术上的弊端，现在已经慢慢被淘汰了。比如合成cDNA第二链时用的是PCR方法，一个物种一般有几万个基因，用一种酶把几万个基因全部扩增到是很难实现的，就像我们平时克隆一个基因经常出现有的酶可以PCR扩增到，有的酶扩不到。而且PCR循环数越多，高拷贝和易扩增的基因冗余度越高，低拷贝和不易扩增的基因慢慢就会丢失，所以很难反映一个物种中基因的真实情况。而invitrogen体系在合成cDNA第二链时是以第一链为模板，通过E.coli.DNA Ligase，E.coli.DNA Polymerase I，T4 DNA Polymerase 等不同酶扩增，能够忠实反映第一链的情况，也就是能够忠实反映mRNA的情况，保证mRNA没有降解，文库构建已经成功一半了。不会造成基因冗余和不均一化的情况。另外由于clontech合成cDNA第二链是PCR的方法，PCR扩增的局限性导致平均插入片段长度较短，一般在500bp左右，这500bp可能包括一部分CDS和UTR，甚至全部都是UTR。如果筛库筛到了，可能就是假阳性，完全没有编码蛋白。invitrogen体系平均插入片段大于1kb，大大减少了全部是UTR的状况，降低了假阳性。clontech体系是线性化质粒一步重组，而invitrogen体系是环装质粒两步重组，线性化质粒的重组率是低于环装质粒的，所以clontech建库后会发现空载率比较高。而环装质粒重组效率高，另外在质粒上加了致死基因，空质粒不会在大肠DH10B中生长，大大降低了空质粒情况。综上，invitrogen体系在库容，重组率，平均插入片段大小方面表现都是优于clontech体系。

  2.为什么有的clontech体系平均插入片段大于1kb？

  正常做是不容易达到的，因为PCR第二链会导致片段小。在cDNA分级分离这一步不采用过柱的方法，直接跑胶切下1kb或1.5kb以上的片段往下重组。这种方法提高了片段大小，但是降低了库容。而invitrogen体系不需要这么做，片段较大，直接过柱除去大部分400-500bp小片段就可以了。

  3.酵母双杂交筛库用三缺是否可行？

  空AD和空BD质粒共转三缺都会长克隆，这么做筛库会造成很高的假阳性。不过确实可以光速交付结果。

  4.酵母单杂交筛库高通量测序是否可行？

  酵母单杂交筛库长出的单克隆，正常操作是直接PCR，单条带且片段较大的送测序。多条带的一般舍弃不用，无法确定哪个是结合蛋白，同时作用还是单独作用（通过划线分离出单条带的单克隆是可行的，但是很繁琐，单杂长的克隆较多，一般没必要在多条带的单克隆上纠结）。而高通量测序无法分辨测序结果是单条带或多条带的单克隆，继而造成假阳性偏高。