Western Blot检测/WB检测

1、蛋白提取

1)        贴壁细胞总蛋白提取：

用TBS缓冲液润洗贴壁细胞2-3次，最后一次尽量吸干残留液。加入适当体积的细胞总蛋白提取试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）于培养板/瓶内裂解3-5min。期间反复晃动培养板/瓶，使试剂与细胞充分接触。用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5mL离心管中。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。4℃13000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。

2)        悬浮细胞总蛋白提取：

低速离心收集细胞，加入适当体积的冷却的PBS缓冲液重悬，2000rpm离心10 min，吸除上清。重复以上操作两次，收集细胞沉淀。加入适当体积的细胞总蛋白提取试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。4℃13000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。

3)        组织总蛋白提取：

组织块用预冷的PBS缓冲液漂洗2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器中。加入10倍于组织体积的组织蛋白提取试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），冰浴彻底匀浆。将匀浆液转移至离心管中，振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保匀浆液完全裂解。4℃13000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。

4)        胞浆胞核蛋白提取：

收集细胞，将细胞重悬于适当体积的浆蛋白提取试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）中，振荡混匀15秒，使细胞完全悬浮并分散开。如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开，可以适当延长振荡混匀时间。冰浴30 min。高速振荡混匀5秒，4℃13000g离心10 min。吸取上清至一预冷的离心管中，即为细胞浆蛋白。吸尽上清（上清尽量去净，避免浆蛋白污染），加入适当体积的核蛋白提取试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），高速振荡混匀15秒，使沉淀完全悬浮并分散开。冰浴30min，每隔5min剧烈振荡混匀10～20s，4℃13000g离心10 min。吸取上清至一预冷的离心管中，即为细胞核蛋白。

2、 蛋白浓度定量

使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度。

3、 SDS-PAGE电泳

1）样品处理

①根据样品浓度确定上样量，保证每个样品总蛋白上样量均为40μg。

②在蛋白样品中加入适当量的5×蛋白上样缓冲液，95-100℃沸水浴5min。

2）制胶与上样

①配制分离胶（见附录1），加入TEMED后立即摇匀灌胶。在胶面上缓慢加入适量水以压平胶面，约45min后倒去胶上层水并用吸水纸将剩余水吸干。

②配制浓缩胶（见附录2），加入TEMED后立即摇匀灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。

③拔出梳子，将电泳架放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，将样品加入点样孔中。

④按浓缩胶80V、分离胶120V进行恒压电泳，至溴酚蓝到达胶板下沿。

4、 转膜

1）准备转膜滤纸和PVDF膜，PVDF膜在使用之前先用甲醇活化。

2）按照正负极的方向摆放转膜“三明治”结构，从正极到负极依次为转膜海绵、3层滤纸、PVDF膜、胶、3层滤纸、转膜海绵，摆放过程中要除尽各层中气泡。

3）按300mA恒流转膜，转膜时间根据目的蛋白分子量大小调整。

5、 抗体孵育

1）将转好的膜加入封闭液室温封闭1h。

2）除去封闭液，加入已稀释好的一抗4℃过夜。

3）回收已稀释的一抗，用TBST洗三次，每次5min

4）加入稀释好的二抗，室温孵育30min，用TBST在室温下摇床上洗四次，每次5min。

6、 化学发光检测

1）滴加新鲜配制的ECL混合溶液到膜的蛋白面侧，暗室中曝光。

2）根据不同的光强度调整曝光条件，显影、定影。

7、 结果分析

将胶片进行扫描存档，AlphaEaseFC软件处理系统分析目标带的光密度值。