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- 2025年07月15日
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lncRNA荧光定量PCR分析
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今发展生物
长链非编码RNA(lncRNA)是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，它们并不编码蛋白，而是以RNA的形式在多种层面上（表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等）调控基因的表达水平。近年来的研究表明，lncRNA参与了X染色体沉默，基因组印记以及染色质修饰，转录激活，转录干扰，核内运输等多种重要的调控过程，lncRNA的这些调控作用也开始引起人们广泛的关注。
图1. lncRNA从多层面调控基因表达
二、lncRNA研究策略
1. lncRNA筛选：
- 通过芯片或测序等方法对疾病模型和对照样本组织进行lncRNA表达谱分析；
- 通过生物信息学的方法筛选出具有表达差异的lncRNA，构建共表达网络，预测lncRNA的靶基因；
- 通过qPCR或Northern Blot等技术对候选lncRNA验证，确定其表达差异。
- 通过5' RACE获取lncRNA 5'全长，3' RACE获取lncRNA3'全长，最终拿到完整的lncRNA序列。
- 细胞水平表达：在细胞水平检测表达差异；
- 组织分布：检测不同组织、不同阶段表达特性；
- 表达水平动力学变化：比较不同处理条件下，如药物处理、诱导处理下，表达水平差异。
- 功能获得性研究：构建lncRNA过表达载体，原则上是将全长lncRNA定向克隆到表达载体上实现lncRNA的过表达。然而有些lncRNA很大或全长尚未分离，这时将视lncRNA在基因组上的定位采取不同的研究策略；
- 功能缺失性研究：可通过RNAi技术沉默lncRNA，干预lncRNA后检测其对疾病相关基因表达的影响和对细胞表型如增值、凋亡、侵袭、转移等影响；
- 采用RNA pull down、RNA-RIP(RNA Binding Protein Immunoprecipitation)、ChIRP-seq(Chromatin Isolation by RNA Purification)等方法检测与lncRNA结合的DNA、RNA、蛋白质；
- 采用lncRNA芯片分析技术结合mRNA对lncRNA功能进行预测，研究lncRNA trans和 cis作用机制；
- 采用配体指数级富集系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，设计一种RNA配体，与癌症相关的lincRNA结合达到抑制肿瘤细胞的生长和转移；
- 采用快速预测RNA与蛋白质相互作用（catRAPID）在线算法来预测RNA与蛋白质的相互作用，该算法根据RNA和蛋白质的二级结构、氢键和分子作用力来评估它们之间的相互作用的倾向；
- 采用非编码RNA沉默和定位分析（c-KLAN）技术对lncRNA进行功能缺失（Loss-of-function）研究和细胞定位，该技术是在基于核糖核酸内切酶制备的小干扰RNA（esiRNA）和荧光原位杂交（FISH） 2种现有的研究方法的基础上建立起来的。
将lncRNA表达与其他领域相结合，解释lncRNA调控机理。
- DNA甲基化：可通过检测相应基因甲基化差异与lncRNA结合分析。
- 转录因子：研究lncRNA与转录因子的调控机制。
- 染色质重塑：lncRNA表观调控。
三、Geneup公司 lncRNA研究产品及服务
1. lncRNA荧光定量PCR分析：Geneup公司将根据您的需求，为您提供lncRNA定量研究服务，并完成数据分析，提供完整的实验报告。客户只需提供待分析的样品及lncRNA序列。
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文献和实验共表达网络分析 • LncRNA表达验证 1. qRT-PCR验证 Ø cDNA质量一定要高，保证没有基因组DNA的污染 Ø 按变化倍数排序，优先选择差异变化明显的lncRNA Ø 按FPKM或reads count排序，优先选择表达量高的lncRNA 2. Northern Blot Ø 既可以验证lncRNA的表达丰度又可以验证序列信息，但精度不如qRT-PCR 3. cDNA末端快速扩增(RACE) Ø 确定lncRNA
组织中 mRNA，lncRNA 和 miRNA 的表达谱。 之后进行 GO 和 KEGG 途径分析失调的 mRNA 的主要功能。并进行 Kaplan-Meier 存活分析以确定差异表达的 lncRNA / mRNA / miRNA 对总体存活的影响。 随后，本研究构建了一个竞争性内源 RNA（ceRNA）网络，其中包括66 个失调的 lncRNAs，24 个 miRNA 和 55 个 mRNA 。并通过 qRT-PCR 分别在 30 对样品中在 ceRNA 网络中证实了四种失调的 lncRNA，三种异常
之后，我的主人开始寻找与我相互作用的分子。我的主人设计了我的 pull-down 实验。即设计几条针对我的反义 DNA 探针，在探针的 3’ 端添加生物素标记。图片来源：quanjing.com然后固定 RNA-Chromatin 交联。并对交联的 DNA 复合物进行超声裂解。使 DNA破碎，添加生物素标记的 DNA 探针在杂交缓冲液中进行杂交。加入生物素抗体磁珠，进行富集。然后冲洗。提取 CHIRP 中的 RNA 用于 qRT-PCR 检测，用于确认lncRNA 分子为特异富集对象，分离 DNA
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