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- Thermo scientific -fermentas
- ER1701
- 2025年09月24日
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|
| Catalog# | Size, concentration | Supplied with: | Certificate of Analysis | MSDS |
| 10X Buffer Tango™ | ||||
| ER1701 | 500 u (10 u/µl) | 1.00 ml | ER1701 | |
| ER1702 | 2500 u (10 u/µl) | 1.00 ml | ER1702 |
| Recommended buffer for 100% activity | Optimal temperature | Enzyme activity in Fermentas buffers, % | Tango™ buffer for double digestion | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| B (blue) 1X |
G (green) 1X |
O (orange) 1X |
R (red) 1X |
Tango™ (yellow) 1X / 2X |
||||
| Tango™ | 37°C | 100 | 100 | 50-100 | 50-100 | 100 | 50-100 | 1X or 2X |
pBR322 DNA
1.4%琼脂糖
22 切割位点
33 mM Tris-acetate (pH 7.9, 37°C), 10 mM Mg-acetate, 66 mM K-acetate, 0.1 mg/ml BSA。
37°C酶切。
10 mM Tris-HCl (pH 7.4, 25°C), 400 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 0.2 mg/ml BSA和50% �v/v)甘油。
备注
- DpnI切割DNA时要求识别序列内部存在修饰碱基N6-methyladenine。
- DpnI酶切底物是从dam+ 菌株中纯化的DNA。
- DpnI只能切割腺嘌呤全部甲基化或半甲基化的dam 位点。半甲基化dam 位点的切割速度慢60倍。
- DpnI、Bsp143I和MboI识别的核苷酸序列相同，但是这些酶的甲基化敏感性不同和切割位置不同。
- 底物为pBR322 DNA。
Dcm: 无重叠 – 不影响。
CpG: 可能重叠 – 不影响。
EcoKI: 无重叠 – 不影响。
EcoBI: 可能重叠 – 影响不确定。
| Methylation type | Sequence | Cleavage effect |
|---|---|---|
| CpG | 5'...Gm6A Tm5C G ...3' |
|
| Dam (GATC) | Gm6ATC |
| bp from the recognition site to fragment end | ||||
|---|---|---|---|---|
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 50-100 | ||||
| Lambda | ΦX174 | M13mp18/19 | pBR322 | puc18/19 | pUC57 |
|---|---|---|---|---|---|
| 116 | 0 | 7 | 22 | 15 | 15 |
| pTZ19R/U | pTZ57R | pBluescriptIIKS(-/+) | pBluescriptIISK(-/+) | pACYC177 | pACYC184 |
| 15 | 15 | 15 | 15 | 22 | 15 |
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文献和实验DpnI mediated site-directed Mutagenesis
, 68°C 2 minutes/kb of plasmid length 3. Degradation of methylated (parental) DNA with DpnI Cool down PCR reaction. Add 1µl Dpn I (10 unit) to PCR reaction 37°C and incubate for 1 hr. 4. Transformation into E. coli
，烘干后溶于无菌水中。（此步可省略，直接用 DpnI酶切）4、DpnI酶切：Buffer 2ul BSA（100╳） 0.2ul DNA x ul DpnI 0.5ul 加无菌去离子水至 20
DpnI mediated site-directed Mutagenesis
length 3. Degradation of methylated (parental) DNA with DpnI Cool down PCR reaction. Add 1µl Dpn I (10 unit) to PCR reaction 37°C and incubate for 1 hr. 4. Transformation into E. coli Place 200 µl highly competent cells (1 x 108/ug efficiency
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